G0期细胞对空间重离子辐射抗性的机理研究

发布时间：2017-03-22 08:15

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【摘要】：精确评估空间高能量重离子辐射风险比较困难,主要原因在于空间重离子辐射的类型和剂量贡献比较复杂,其次在于指数生长期体外培养细胞等生物实验模型与人体实际环境差别较大。人体大部分细胞都处于静息期(G0期),受到外源性刺激后能够进入G1期等正常的细胞周期。所以在本论文的研究中,我们以利用接触抑制法构建的处于G0期的人肺胚正常成纤维细胞(MRC-5)为实验模型;同时,鉴于G1期细胞与常规指数生长期细胞的辐射敏感性相似但DNA含量却与G0期细胞相同,我们以G1期细胞作为对照实验模型进行比较研究。本研究主要采用细胞周期测定法、克隆存活法、免疫荧光法、微核阻断法、蛋白质免疫印迹和GST pull down等实验技术,研究了不同重离子辐照后G0期细胞的辐射效应以及p38和RAC2对细胞辐射敏感性的调控作用,实验结果如下:1、G0期细胞与G1期细胞和指数期细胞相比具有显著的辐射抗性。利用传统的指数生长期细胞进行空间辐射评估高估了空间辐射风险。2、照射后,G0期细胞的自由基浓度显著低于G1期细胞。RAC2作为NADPH氧化酶的催化亚基,照射后在G0细胞中低表达,但是在G1期细胞中高表达。RAC2在G0期细胞的低表达导致G0期细胞的NADPH氧化酶低活性,所以G0期细胞内的自由基产额较小,产生的DNA双链断裂和单链断裂损伤较少。另外,G0期细胞的NADPH氧化酶低活性使细胞内具有高浓度的NADPH,G0期细胞的总抗氧化活性高于G1期细胞。这些发现从自由基发生的角度解释了G0期细胞辐射抗性的分子机理。3、照射后,P38MAPK在G0期细胞的表达下调,在G1期细胞内的表达量上调,磷酸化P38MAPK在G0期细胞内表达上调,在G1期细胞内表达下调。照射后,P38MAPK通过与RAC2互作,共定位于细胞核区域,降低RAC2的效价,导致细胞自由基浓度降低。此外,P38MAPK磷酸化能够增加细胞的辐射抗性。G1期细胞内高浓度的自由基引起P38MAPK的去磷酸化,最终导致G1期细胞辐射敏感性高于G0期细胞。P38MAPK、磷酸化P38MAPK和RAC2形成互相调节的反馈与负反馈通路,从而决定G0期细胞和G1期细胞辐射敏感性差异,导致G0期细胞具有更高的辐射抗性。
【关键词】：空间辐射 RAC2 自由基 P38MAPK 辐射敏感性
【学位授予单位】：中国科学院研究生院（近代物理研究所）
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q274
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 研究背景13-30
• 1.1 空间辐射13-17
• 1.1.1 空间辐射类型13-14
• 1.1.2 空间辐射的危害14-15
• 1.1.3 国际空间辐射生物学与医学研究现状15-16
• 1.1.4 我国空间辐射生物学与医学研究现状16-17
• 1.2 自由基与NADPH氧化酶17-27
• 1.2.1 自由基理论17-25
• 1.2.2 NADPH氧化酶25-27
• 1.2.3 RAC2与自由基关系27
• 1.3 P38MAPK的功能27-30
• 第二章 材料与方法30-49
• 2.1 主要试剂与耗材30-31
• 2.2 主要仪器31-33
• 2.3 细胞培养33
• 2.4 辐照条件33-34
• 2.5 细胞模型的建立34-35
• 2.6 细胞存活能力的测定35-36
• 2.7 免疫荧光法检测细胞DNA损伤36-38
• 2.8 基因组不稳定性检测38-39
• 2.9 流式细胞术分析细胞周期39-41
• 2.10 细胞内活性氧自由基的检测41-42
• 2.11 细胞还原力检测42-43
• 2.12 蛋白质免疫杂交检测细胞特定蛋白的表达43-46
• 2.13 GST Pull-down实验验证蛋白的互作46-47
• 2.14 转录组测序测定细胞的m RNA转录情况47-49
• 第三章 实验结果49-82
• 3.1 G0/G1期细胞模型的建立与验证49-51
• 3.2 模拟研究G0/G1期细胞空间重离子辐射敏感性51-55
• 3.2.1 重离子辐射G0期细胞存活率明显高于G1期细胞51-53
• 3.2.2 重离子辐射后 G0 期细胞的 DNA 双链断裂损伤显著低于 G1 期细胞53-54
• 3.2.3 LET 与 G0/G1 期细胞辐射敏感性的关系54-55
• 3.3 G0/G1期细胞辐射敏感性差异的机理一：自由基产额差异决定细胞辐射敏感性55-67
• 3.3.1 照射后G0期细胞的自由基产额显著低于G1期细胞55-56
• 3.3.2 RAC2决定NADPH氧化酶的活性56-60
• 3.3.3 NADPH氧化酶活性决定细胞的自由基产额60-62
• 3.3.4 G1期细胞高表达的RAC2显著增加细胞内DNA损伤数量62-64
• 3.3.5 G0期细胞的总抗氧化活性（TAC）显著高于G1期细胞64-67
• 3.4 G0/G1期细胞辐射敏感性差异的机理二：磷酸化P38MAPK表达差异决定细胞辐射敏感性67-70
• 3.4.1 G0期细胞的磷酸化P38MAPK表达量显著高于G1期细胞67-69
• 3.4.2 磷酸化P38MAPK增加细胞的辐射抗性69-70
• 3.5 G0/G1期细胞辐射敏感性差异的机理三：P38MAPK通过与RAC互作影响自由基产额70-76
• 3.5.1 P38MAPK α 亚基GST Pull-down证明RAC2与P38MAPK互作 . 593.5.2 照射后G0期细胞中P38MAPK聚集降低了RAC2的效价71-74
• 3.5.2 照射后 G0 期细胞中的 P38MAPK 的聚集趋势降低了 RAC2 的效价74-76
• 3.6 G0/G1期细胞辐射敏感性差异的机理四：高浓度自由基导致的P38MAPK去磷酸化降低细胞辐射抗性76-80
• 3.6.1 自由基浓度升高导致P38MAPK去磷酸化77-78
• 3.6.2 P38MAPK的去磷酸化不影响自由基的产额78-80
• 3.7 P38MAPK、磷酸化P38MAPK与RAC2的互作网络与自由基产额和细胞辐射敏感性的关系80-82
• 第四章 讨论82-85
• 第五章 结论与展望85-87
• 5.1 结论85-86
• 5.2 展望86-87
• 参考文献87-104
• 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果104-105

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1 裴海龙;G0期细胞对空间重离子辐射抗性的机理研究[D];中国科学院研究生院（近代物理研究所）;2015年

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本文编号：261185