烟草叶绿体透性酶NtPIC1基因的克隆及其功能研究

发布时间：2020-07-13 05:44

【摘要】：铁是植物生长和发育必需的基本元素,在多种细胞反应过程中扮演重要角色包括光合作用,呼吸作用,叶绿素合成及DNA合成等。在叶绿体中,铁是光合作用电子传递链的必需成分,是超氧化物歧化酶的辅助因子。因此铁稳态对于叶绿体及植物生长发育都是至关重要的。本研究克隆了烟草NtPIC1基因,通过过表达及RNAi手段,研究了NtPIC1在烟草铁代谢中的作用。分析了转NtPIC1基因烟草对其他重金属的响应,尤其是NtPIC1-OX转基因烟草对于Cd胁迫的耐受性。主要研究结果如下:1.利用RT-PCR技术克隆了烟草NtPIC1基因全长cDNA,NtPIC1定位在叶绿体膜上,Southern blot鉴定该基因在烟草基因组中为单拷贝基因。在根、茎、叶、花中均表达,经酵母铁缺失突变体fet3fet4功能互补实验证明,NtPIC1具有铁转运功能。2.构建了RNAi植物表达载体pRNAi-NtPIC1和过表达植物表达载体pBI121-NtPIC1。利用农杆菌介导转化方法,将NtPIC1基因导入烟草细胞核基因组中。通过PCR,q RT-PCR检测及Southern blot检测,获得NtPIC1-RNAi转基因植株和NtPIC1-OX过表达转基因植株。3.NtPIC1-RNAi和NtPIC1-OX植株的叶绿体铁含量及叶绿素含量显示:NtPIC1-RNAi植株表现为失绿症,叶片白化,植株矮小,叶绿体铁含量缺乏、叶绿素含量下降并且叶片的叶绿体及其中的类囊体膜严重降解。而NtPIC1-OX植株的叶片呈现深绿色,与WT相比叶片含有高水平的叶绿素含量及叶绿体铁含量。NtPIC1-OX植株的叶绿体中类囊体紧实堆叠,其中还有很多光合作用产物淀粉颗粒。4.通过qRT-PCR分析了NtPIC1-RNAi和NtPIC1-OX植株的铁代谢相关基因的表达量。结果表明与WT相比转基因植物(NtPIC1-RNAi和NtPIC1-OX)的铁转运基因,铁氧化胁迫基因,铁硫蛋白合成基因的表达量发生改变,说明NtPIC1影响了植物的铁稳态。5.通过酿酒酵母野生型BY4741转化空载体pYES及转化基因pYES-NtPIC1,转化酵母在含有不同金属的培养基中培养,发现随着酵母稀释浓度的增加,与转空载体pYES相比,转pYES-NtPIC1酵母在含金属Ni,Cu,Co的培养基上长势更弱,说明转pYES-NtPIC1酵母对这些金属更加敏感,而在含重金属Cd的培养基上转pYES-NtPIC1酵母生长的更好,说明异源表达NtPIC1对重金属Cd有更强的耐受性。6.Cd胁迫下,通过观察WT植株与NtPIC1-OX植株生长表型,发现NtPIC1-OX植株有更高的鲜重量及更长的主根,与WT植株相比,过表达植株的根长抑制率也更低。经过Cd胁迫,WT植株比NtPIC1-OX植株叶片更加黄化且植株矮小。测量地上及地下部分的铁和镉含量发现,NtPIC1-OX植株根部铁含量比WT植株低,但地上部分铁含量高于WT植株,说明NtPIC1-OX植株地下向地上的铁转运能力更强。而NtPIC1-OX植株的根部和地上部分Cd含量则显著少于WT植株。7.qRT-PCR分析了在正常MS及Cd胁迫条件下NtPIC1-OX和WT植株中与金属转运相关基因的表达量。结果发现,在NtPIC1-OX植株中,地上部分铁转运基因NtPIC1,根部的NtNRAMP1和NtFER1与WT植株相比显著上调表达,说明NtPIC1-OX植株地上部分的铁含量较高,可能依靠这些基因上调表达实现的。铁代谢相关基因NtFRO1,NtIRT1及NtZIP1,同时也是Cd转运体的这些基因,在NtPIC1-OX植株根部显著下调表达,说明NtPIC1-OX植株中Cd的吸收和累积量较少可能依赖于这些基因的下调表达实现的。8.通过分析抗氧化指标测定结果发现,在正常培养基MS和含有Cd胁迫培养基的培养条件下,NtPIC1-OX植株的抗氧化酶SOD,POD,CAT活性均显著高于WT植株,而MDA含量显著低于WT植株。研究结果表明,在Cd的胁迫下,过表达NtPIC1是一种有效的方式来增加地上部分铁含量以提高Cd胁迫下植株抗氧化损伤的能力。
【学位授予单位】：哈尔滨师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2

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