嵌合型猪圆环病毒1-2b转染方法优化及PCV1-2b 1B和1C疫苗免疫保护效力研究

发布时间：2020-08-14 15:26

【摘要】：猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)为圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)成员,包括PCV1 (Porcine circovirus type 1, PCV1)和PCV2 (Porcine circovirus type 2, PCV2)两种血清型。PCV1是猪肾细胞系的一种污染物,对猪无致病性；PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)及其他猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的主要病原。PCV2主要分为PCV2a和PCV2b两个基因型,PCV2a包括2A-2E五个亚型；PCV2b包括1A、1B和1C三个亚型,其中1A、1B亚型的ORF2基因序列基本一致,进一步区分需比较ORF1序列。1C亚型的ORF2基因与1A、1B相比有较大差异,其Cap蛋白C末端出现一个赖氨酸(K)的延伸。PCV2已在全世界猪群蔓延,给养猪业带来巨大的经济损失。疫苗接种是预防PCV2感染的有效手段。然而疫苗免疫不能完全阻断PCV2的感染和传播,而且商品化的疫苗价格普遍居高,制约着PCV2疫苗的广泛使用。因此研发安全、高效、低价的疫苗产品是今后研究的主要方向。本研究使用电穿孔转染法证实Dulac细胞能显著提高嵌合型PCV1-2b拯救效率,突破病毒增殖的瓶颈；大量制备嵌合型PCV1-2b舌病毒,动物试验评估嵌合型PCV1-2b灭活疫苗和活疫苗的断奶仔猪主动免疫及新生仔猪被动免疫保护效果。1. Dulac细胞拯救嵌合型PCV1-2b的转染方法优化本研究通过优化脂质体转染法和电穿孔转染法,将本室保存的pSK-dPCV1-2b重组质粒分别转染Dulac细胞和PK-15细胞,旨在提高嵌合型猪圆环病毒PCV1-2b的拯救效率,为疫苗生产奠定基础。结果显示,Dulac刚包转染后的病毒滴度为PK-15细胞的100倍；Dulac细胞电转染的优化参数为250 V、400μs、6μg质粒DNA、电击3次,各因素对转染效率的影响依次为电场强度、电击次数、脉冲时间及质粒DNA含量。Dulac细胞脂质体转染优化结果为：在质粒DNA与转染试剂比例为1：3时,转染效率最高。流式细胞术检测Dulac细胞电转染和脂质体转染的感染率,结果阳性细胞数分别占55.6%和44.2%,提示两种方法转染Dulac细胞的效率均较高。分别将拯救的病毒在Dulac细胞和PK-15细胞上进行连续传代,结果病毒滴度随着传代数呈上升趋势,但Dulac细胞病毒滴度(10444-105.32)显著高于PK-15细胞(101.90-103.38)。因此,嵌合型PCV1-2b在Dulac细胞中增殖滴度更高,优化脂质体转染法和电穿孔转染法均能有效提高Dulac细胞的病毒拯救效率。2.嵌合型PCV1-2b灭活疫苗和活疫苗免疫保护效力比较根据PCV2 ORF1的保守序列,设计1对特异性引物和TaqMan探针,建立PCV2 TaqMan荧光定量PCR检测方法,并评价其敏感性、特异性和重复性。结果显示,标准曲线的斜率为-3.55,相关系数R2为0.999,扩增效率为96.4%,具有良好的线性关系；该方法的敏感性为5.0 copies/μL;检测的PCV1-2、PCV1、CSFV、PRRSV、PRV、PPV基因组DNA或cDNA均无扩增曲线；8份阳性样品的变异系数在0.98%-1.03%之间。因此,本研究建立的PCV2 TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性强,敏感性高,重复性良好,为嵌合型PCV1-2b疫苗免疫保护效力评估提供了科学有效方法。用抗原含量为2×105.0TCID50/mL的嵌合型PCV1-2b灭活疫苗和2×104.0TCID50/mL的嵌合型PCV1-2b活疫苗分别免疫商品猪,并以商品化PCV2b全病毒灭活疫苗作对照,评估两种疫苗的免疫保护效力。结果显示,免疫组试验猪均能迅速产生体液免疫反应,活疫苗免疫猪血清抗体和中和抗体产生更早,高水平抗体维持时间更长。TaqMan荧光定量PCR检测攻毒后血清和腹股沟淋巴结PCV2 DNA拷贝数,结果攻毒对照试验猪血清和腹股沟淋巴结检测到大量的PCV2核酸载量,活疫苗组攻毒后21d能完全消除PCV2增殖,而灭活疫苗组有1头猪血清样品检测到PCV2核酸(105.55copies/mL);灭活疫苗和活疫苗组均有2头试验猪腹股沟淋巴结检测到PCV2 DNA载量(108.28、107.50 copies/g和105.93、105.57copies/g),嵌合型PCV1-2b活疫苗组低于灭活疫苗组,但差异不显著(P0.05)。病理组织学观察结果显示,攻毒对照猪可见严重的间质性支气管肺炎病变,淋巴结出现淋巴细胞缺失和组织细胞浸润等病理损伤,IHC检测呈PCV2抗原阳性,而免疫组病变比攻毒对照组轻微。PCV2可通过口、鼻、粪尿等排泄物进行传播,将病毒液接种试验猪后发现,攻毒对照猪鼻拭子和肛拭子样品中PCV2核酸载量显著高于免疫组试验猪(P0.05)。因此,嵌合型PCV1-2b灭活疫苗和活疫苗能够诱导机体产生有效的免疫保护,降低PCV2水平传播的风险,可作为防控PCV2感染的候选疫苗。3.嵌合型PCV1-2b灭活疫苗免疫母猪对所产仔猪免疫保护作用嵌合型PCV1-2b灭活疫苗对断奶仔猪的免疫保护效力已经在第二章得到证实,本研究将制备的嵌合型PCV1-2b灭活疫苗免疫妊娠母猪,对其所产14日龄,28日龄和42日龄仔猪进行攻毒,评价新生仔猪的被动免疫保护效力。结果显示14日龄仔猪攻毒前母源抗体滴度最高,平均值为1：300,28日龄和42日龄仔猪血清抗体水平逐渐下降,平均值分别为1：133和1：70,至49日龄时血清中几乎无母源抗体。14日龄仔猪仅在攻毒后]4 d有1头猪血清中检测到低拷贝数的病毒载量(104.90copies/mL),淋巴结观察到轻微的淋巴细胞缺失,IHC检测为阴性；28日龄仔猪母源抗体较低,PCV2攻毒后14 d和21 d分别有2头猪出现不同程度的病毒血症(分别为105.36copies/mL、106.39copies/mL和107.84 copies/mL、107.90 copies/mL)；42日龄仔猪攻毒后,PCV2在体内的增殖得不到有效抑制,攻毒后7d血清中有1头猪检测到PCV2核酸拷贝数,21 d的血清和淋巴结病毒载量接近攻毒组水平,平均值分别达10631 copies/mL和1010.77copies/g,组织病理学发现淋巴细胞流失严重并伴有巨噬细胞浸润,IHC检测到棕黄色阳性细胞。因此,本研究证明了嵌合型PCV1-2b灭活疫苗免疫妊娠母猪,14日龄仔猪获得良好的保护效力,28和42日龄仔猪被动免疫保护降低：将仔猪的首免日期定在28日龄左右。4.嵌合型PCV1-2b 1B和1C亚型灭活疫苗免疫保护效力比较本研究以本室保存的pSK-sPCV1-2b 1C重组质粒为骨架,构建pSK-dPCV1-2b 1B感染性克隆,电穿孔转染法拯救嵌合型PCV1-2b 1B病毒,动物试验评价两种嵌合型PCV1-2b灭活疫苗免疫保护效力的差异。生长动力学显示,两株嵌合型PCV1-2b呈现相似的增殖特性。试验猪免疫后产生快速的体液免疫应答,能显著降低机体PCV2病毒载量,但免疫组之间无显著差异(P0.05)。嵌合型PCV1-2b 1B灭活疫苗诱导的荧光抗体和中和抗体略高,血清病毒含量较低,在攻毒后14 d和21d能完全抑制PCV2b曾殖,腹股沟淋巴结不携带PCV2b核酸,IHC检测呈阴性；嵌合型PCV1-2b 1C灭活疫苗组攻毒后21 d不能完全抑制病毒增殖,1头猪血清中检测到病毒载量(105.75copies/mL);腹股沟淋巴结亦有1头猪可检测到PCV2b核酸(108.16copies/g), IHC检测呈弱阳性,并出现轻微的病理损伤。鼻拭子和肛拭子病毒含量显示攻毒猪排毒量与血清中病毒核酸载量呈正相关,免疫组PCV2b病毒核酸载量显著低于攻毒对照组(P0.05)。因此,不同的Cap蛋白对嵌合病毒的增殖特性无明显影响,断奶仔猪接种嵌合型PCV1-2b 1B和1C灭活疫苗获得的免疫保护效力无显著差异。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.651
【图文】：

电镜图,病毒粒子,电镜

２形态学及生物学特征逡逑ＰＣＶ２是至今发现最小的动物病毒，在电镜下观察为直径约１７－２２ｎｍ，呈球形、边缘逡逑较清晰无裹膜的病毒粒子，见图１。由于病毒由衣壳蛋白和单链ＤＮＡ组成，ＰＣＶ２对酒精、逡逑氯仿、舰和苯酷等脂溶性消毒剂具有较强的抵抗力，但易被碱性消毒剂、氧化物、四价氨逡逑化合物灭活ｔＷ。病毒不具有血凝性，７０’Ｃ邋１５邋ｍｉｎ和ｐＨ邋３．０的酸性环境仍保持感染性［１２１。逡逑病毒粒子在ＣｓＣｌ中的浮为密度为１．３６邋ｇ／ｍＬ１．３７邋ｇ／ｍＬ，沉降系数为５７邋Ｓ。ＰＣＶ２可感染不逡逑同来源的动物细胞ｆｉｗｙ，但只在猪源和Ｖｅｒｏ细胞系中增殖，不产生ＣＰＥ。逡逑

基因组,情况,病毒基因组,蛋白

即邋ＯＲＨ－ＯＲＦｌｌ，ＰＣＶｌ邋与邋ＰＣＶ２邋的邋ＯＲＦｌ、２、３、４、７、８邋具有一定同源性，其余逡逑ＯＲＦｓ无同源化见表１＾气其中，ＯＲＦ１、５、７和１０位于病毒基因姐的正链上；ＯＲＦ２、逡逑３、４、６、８、９和１１位于病毒基因组的互补链上，见图２ＰＳ１。ＯＲＦ１和ＯＲＦ２为ＰＣＶ２最逡逑大的两个ＯＲＦｓ，编码的Ｒｅｐ蛋白和Ｃ巧蛋白使病毒基因组能够复制并组装成成熟的子代逡逑病毒。逡逑

序列,六聚体,重复序列

Ｒｅｐ和Ｃａｐ基因之间，该区域包含圆环病毒属复制特有的茎环结构（ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ）及顶部保逡逑守的九聚体序列（ＡＸＴＡＸＴＡＣＣ），在其两侧有一段１１个核昔酸的重复序列（回文区域）。逡逑邻近回文区域有六聚体和五聚体的重复，见图３。Ｒｅｐ和Ｒｅｐ＇蛋白的结合位点为３＇－端的反逡逑向重复和六聚体Ｈ１和Ｈ２，邋Ｒｅｐ和Ｒｅｐ＇蛋白结合使ｄｓＤＮＡ解链，然后暴露的ｓｓＤＮＡ形成逡逑九聚体序列，Ｒｅｐ和Ｒｅｐ＇蛋白识别切开起始病毒的复制Ｃｈｅｕｎｇ等（２００３）研究证明，逡逑ＰＣＶ在感染细胞后，ＯＲＦ１转录产生８种ＲＮＡｓ，其中民巧、Ｒｅｐ＇、民ｅｐ３ａ、Ｒ巧化、Ｒｅｐ３ｃ逡逑可（＾１通过Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测到，ＮＳ５１５、Ｗ６７２和ＮＳ０含量较低，只能通过ＰＣＲ方法检逡逑测到１４５１。运用点突变方法证明，民巧和Ｒｅｐ＇蛋白是病毒复制必须的原件，但其他较小的ＲＮＡｓ逡逑是否编码蛋白Ｗ及它们在病毒生命周期的作用尚未明确１４６’４７１。逡逑－逡逑Ｉ＂＊邋Ｖ逦＇７１邋？逡逑＼邋ｊｔ逦Ｏｒｉｇｉｎ邋ｏｆ邋ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ逡逑＜＊■邋Ｉ逦ＪｌＯＧＡＣ逡逑…邋说逦Ｈ３逦饼．逡逑卢ｓ逡逑０ＲＦ２邋ｅｎｃｏｄｅｓ邋乐逦％邋ａ一逡逑Ｃａｐ邋ｐｆｏｌｅｉｎ邋ｍ逦NB。。逡逑§逦■邋ｅｎｃｏｄｅｓ邋Ｒｅｐ邋ａｎｄ邋Ｒｅｐ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ逡逑画逦Ｇｅｎｏｍｅ邋Ｏｆ邋悘逡逑图３邋ＰＣＶ茎环结构和六聚体重复序列（引自ＩＷ）逡逑Ｆｉｇ．邋３．邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｏｆ邋ＰＣＶ２逡逑５．２邋ＯＲＦ２逡逑ＯＲＦ２基因位于病毒核酸的负链上

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