Latcripin-13功能域的克隆表达、纯化及其生物学活性研究

发布时间：2020-08-19 21:35

【摘要】：背景:肺癌是威胁人类生命健康最大的恶性肿瘤之一。其发病机制复杂,现代医学手段缺乏对其早期检测和筛选的有效方法。人们在分子水平上对肺癌的认识明显不足,这就迫切需要通过寻找肺癌的新分子特征和靶点来改进诊断方法并最终达到靶向治疗。许多有效的抗癌药物已从自然资源中开发。大多数抗癌药物都来自动植物的次生代谢产物和其它小分子化合物。然而,近年来生物大分子的活性引起了研究人员的广泛关注。蚯蚓纤溶酶(EFE)在体外和体内都对肝癌细胞表现出显著的抗肿瘤活性。此外,来自云芝CM-101菌株的一种糖蛋白在体内体外都表现出了显著的抗肿瘤活性。此外,天花粉蛋白——I型核糖体失活蛋白,可抑制多种肿瘤细胞株的生长并诱导凋亡。香菇是世界第二大食用菌,同时也是我国特产之一。香菇隶属于担子菌纲,伞菌目,口蘑科,香菇属。香菇含有高蛋白、低脂肪、多糖、多种氨基酸和多种维生素,是一种名贵的食药两用真菌,在民间素有山珍之王之称。香菇中含有的香菇多糖可以提高机体的免疫力。香菇中的水提取物对体内的过氧化氢有一定的消除作用,在一定程度上也起到延缓衰老的作用。除此之外,香菇对糖尿病,肺结核,传染性肝炎,神经炎,便秘,降血压,降胆固醇,降血脂等起治疗作用,又可预防动脉硬化,肝硬化等疾病。我课题组自1990年开始,根据当时国际针对香菇药用价值研究,采用生物工程发酵技术对6株香菇进行菌丝发酵,发现一株经发酵后其发酵液具有直接抗肿瘤作用,因该菌株于1991年3月开始研究,故命名为“C91-3”,“C”表示“China”。基于发酵液中的一些蛋白组分在体内外的实验中表明具有诱导细胞凋亡的能力,我课题组对香菇C91-3菌株转录组进行了高通量测序,获得了大量的Unigene及其功能注释信息。其中Unigene为28923条,具有编码框的Unigene有18120条。根据基因功能注释初步结果,利用在线工具软件Sanger Pfam进行结构域分析,从Unigene序列中筛选出凋亡相关基因Latcripin-13。根据Latcripin-13转录组序列设计引物,用3′-Full RACE(Rapid Amplificatioon of c DNA Ends,RACE)、5′-Full RACE方法获得Latcripin-13基因编码序列(Coding Sequence,CDS)。目前,我们已经完成了Latcripin-13基因编码序列在Gen Bank上的序列注册(Accession Number:KF682439)。目的:通过构建p ET-32a(+)表达载体将香菇C91-3菌株凋亡相关蛋白Latcripin-13功能域在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中进行诱导表达,同时对表达产物进行鉴定。通过诱导表达香菇C91-3菌株凋亡相关蛋白Latcripin-13功能域,研究其对肿瘤细胞的生物学功能影响,探讨其诱导肿瘤细胞凋亡的机制,为将其开发成为新型抗肿瘤药物提供依据。方法:(1)提取香菇C91-3菌株菌丝体总RNA,参照转录组的测序结果,通过3'-Full RACE、5'-Full RACE方法获得Latcripin-13基因编码序列。经生物信息学软件分析该蛋白的氨基酸组成和理化性质及结构域。(2)设计特异性引物,利用RCR技术获得Latcripin-13功能域序列并将其基因克隆到原核表达载体p ET32a(+)中,构建原核重组表达质粒p ET32a(+)-truncated-latcripin-13,将此质粒转化到大肠杆菌Ecoli.Rosetta-gami(DE3)中并进行诱导表达,用SDS-PAGE及Western blot方法对表达产物进行鉴定。用镍柱亲和层析的方法进行分离纯化并用BCA法测定蛋白浓度。用尿素梯度透析的方法对目的蛋白进行复性,并用圆二色光谱的方法对复性后的蛋白进行鉴定。(3)Latcripin-13功能域抗肿瘤活性的鉴定:MTT(Methyl Thiazoly Ltetra Zolium,MTT)法测定其对人肺腺癌A549细胞的增殖抑制率;用FITC标记Latcripin-13功能域,并用荧光显微镜观察其在A549细胞中的定位;用电镜法检测其对A549细胞形态学的影响;用33258染色法检测观察其对A549细胞凋亡的影响;流式细胞术检测其对A549细胞的凋亡作用及细胞周期的影响;JC-1的方法检测其对A549细胞线粒体膜电势的影响;用分光光度法检测其对caspase-3,-8,-9酶活性的影响;用Western blot的方法检测Bcl-2,Bax,CCD1,CDK4,NF-κB,GSK3β,p-GSK3β表达水平的变化。结果:(1)利用RACE方法获得了Latcripin-13基因编码序列。通过对Latcripin-13氨基酸序列进行结构域分析,发现该蛋白三级结构含有染色体浓缩调节子(RCC1)和植物同源结构域(PHD)。(2)应用PCR技术获得了latcripin-13功能域基因片段,通过Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切验证插入p ET32a(+)中的片段为latcripin-13功能域基因片段。SDS-PAGE和Western blot结果证明蛋白Latcripin-13功能域在大肠杆菌Ecoli.Rosetta-gami(DE3)中成功诱导表达。利用亲和层析的方法将其成功纯化,圆二色光谱验证结果显示其复性成功。(3)MTT法检测结果显示,Latcripin-13功能域作用于A549细胞呈现出浓度和时间的依赖关系(P0.05);荧光显微镜观察其确实进入A549细胞,并分布在细胞核周围;电镜的结果显示该蛋白诱导A549细胞发生凋亡,并呈现出早期凋亡的基本现象;33258染色结果显示,该蛋白确实能诱导A549细胞凋亡,并呈现出核碎裂和染色体皱缩等凋亡现象;流式细胞术结果显示,100μg/ml该蛋白诱导A549细胞凋亡呈现出时间依赖关系,同时100μg/ml BSA对照组对A549无显著凋亡的作用;细胞周期检测结果显示,Latcripin-13功能域蛋白对A549细胞产生G0/G1期阻滞作用。JC-1结果显示,随着Latcripin-13功能域蛋白作用浓度的增加,线粒体膜电势发生改变;分光光度法结果显示,100μg/ml该蛋白作用于A549细胞时,caspase-3,-8,-9被活化;Western blot结果显示,随着Latcripin-13功能域蛋白作用浓度的增加,Bax/Bcl-2比值增加(p0.05),GSK3β/p-GSK3β比值增加(p0.05),NF-κB,CCD1,CDK4表达量降低。结论:(1)根据香菇C91-3菌株的转录组序列,成功筛选出凋亡相关基因Latcripin-13,并成功获得Latcripin-13基因编码序列。(2)成功获得Latcripin-13功能域片段序列;重组质粒p ET32a(+)-truncated-latcripin-13成功构建;目的蛋白Latcripin-13功能域在大肠杆菌Ecoli.Rosetta-gami(DE3)中成功表达;蛋白Latcripin-13功能域通过亲和层析成功纯化;包涵体蛋白Latcripin-13功能域经尿素梯度透析成功复性。(3)Latcripin-13功能域蛋白进入人肺腺癌A549细胞系并对其具有诱导凋亡作用,其可能通过细胞周期G1期阻滞,NF-κB途径和线粒体途径共同作用其凋亡。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2

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