家蚕肠道免疫相关分子的鉴定及功能研究

发布时间：2020-09-05 11:17

　　 昆虫拥有一个在进化上保守的先天免疫系统来识别和消灭入侵的病原微生物。而肠道屏障是昆虫先天免疫的第一道防线,为了抵御病原微生物的感染,昆虫肠道形成了一套完整的免疫应答体系。尽管在昆虫肠道中通过基因组、蛋白质组的同源序列比对或者直接与病原微生物结合的方法鉴定到了多个免疫相关分子,但是对于昆虫肠道免疫应答的机制以及未知的肠道免疫分子的了解还是有限的。因此,本文的目的就是通过新的方法来鉴定家蚕(Bombyx mori)肠道中未知的免疫相关分子并且进一步研究它们参与免疫应答的分子机制。本研究为了进一步鉴定新的家蚕肠道免疫相关分子,构建了家蚕中肠T7噬菌体cDNA展示文库,并且利用不同的生物学配体如几丁质(Chitin)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、黑胸败血芽胞杆菌(Bacillus bombyseptieus,Bb)以及沙雷氏菌(Serratia marcescens,Sm)等对所构建的噬菌体展示文库进行生物学淘选。并进一步对所淘选到的分子进行生物学验证以及对其参与肠道免疫应答的机制进行揭示。获得的主要结果如下:1.构建家蚕中肠cDNA T7噬菌体展示文库以及配体结合多肽的淘选构建了家蚕中肠cDNA T7噬菌体展示文库,插入片段大小在300 bp-2000 bp之间,文库原始滴度为1×105 pfu/m L,扩增后的滴度为8×1010 pfu/m L,文库重组率为96%,重组子中大约有57%的插入片段大于250 bp。用几丁质、脂多糖、黑胸败血芽胞杆菌和沙雷氏菌为配体淘选噬菌体展示文库,获得了多个免疫相关候选蛋白,如翻译控制的肿瘤蛋白、几丁质结合蛋白、氨肽酶N、真菌蛋白酶抑制剂F以及β葡聚糖识别蛋白等。其中在用上述四种不同配体淘选的时候都能获得翻译控制的肿瘤蛋白,说明该蛋白可能参与对上述几种配体的识别。2.细胞水平上鉴定家蚕TCTP的免疫功能免疫组化和Western blotting结果显示,TCTP由肠道细胞合成并分泌到肠腔中,但不能穿透围食膜进入肠液。另外,血淋巴中也检测到少量TCTP的存在。微生物感染家蚕,肠道可溶性TCTP呈现先上升后下降的趋势。血细胞吞噬实验结果表明,TCTP能与微生物结合,促进血细胞对微生物的吞噬,起着调理素的作用。另外,TCTP可以诱导家蚕Bm Ns细胞产生抗菌肽,用ERK抑制剂U0126和PD098059能抑制TCTP诱导家蚕细胞产生抗菌肽,且具有剂量依赖效应。家蚕细胞瞬时干涉ERK后,TCTP不能诱导其产生抗菌肽。ERK磷酸化抗体免疫印迹结果显示,TCTP能诱导家蚕细胞ERK发生动态磷酸化的变化,且在5 min磷酸化水平最高,持续到10 min,之后逐渐降低,30 min降到起始水平。3.个体水平上验证家蚕TCTP的免疫功能成功构建了家蚕中肠TCTP转基因干涉载体,获得了稳定遗传的转基因干涉品系。通过q RT-PCR和Western blotting检测发现与正常大造相比,转基因干涉家蚕的中肠TCTP无论在转录水平还是翻译水平都得到了有效干涉。对转基因家蚕添食致病微生物后,发现转基因干涉中肠TCTP的家蚕抗菌肽不能被诱导上调表达,且家蚕存活率降低。用磷酸化的ERK抗体免疫印迹结果显示,正常大造感染微生物后ERK会发生磷酸化的动态变化,而转基因干涉中肠TCTP的家蚕添食微生物后,ERK的磷酸化水平比较低,且在感染的前12 hr呈现一直下降的趋势,12 hr后有升高的趋势。综上所述,转基因干涉家蚕中肠TCTP感染微生物后,扰乱了ERK磷酸化的动态变化,导致抗菌肽的产生下降,并进一步降低了家蚕的存活率。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：Q966
【部分图文】：

图 1.1 果蝇体液免疫应答模式图[9]Fig 1.1 Schematic diagram of humoral immune response in Drosophila.2 昆虫局部性免疫应答所谓局部性免疫应答是指发生在器官表皮的免疫反应，包括外表

图 1.2 果蝇局部免疫应答模式图[20]Fig 1.2 Schematic diagram of local immune response in Drosophila1.3 家蚕分子免疫研究进展我国栽桑养蚕已有几千年的悠久历史，蚕桑产业也成为我国经济发展的主要

图 1.3 TCTP 和 Mss4 的结构比较[54]Fig 1.3 Fold of TCTP and comparison with Mss4a，b，TCTP 的结构；c，d，Mss4 的结构。a，c 相同的颜色代表相似的结构。b，d 红色代表两个蛋白结构的差异区域。of TCTP. c,d, Fold of Mss4. Panels (a) and (c) are colored to show the common core of the tw

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本文编号：2812955