二十五株丝状真菌及其次级代谢产物的分离纯化与鉴定

发布时间：2020-09-12 12:40

　　植物内生真菌和毛壳属真菌是具有高度多样性的微生物资源,可以产生多种多样结构新颖的次级代谢产物,而且这些代谢产物大多具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、降血糖、免疫抑制、抗病毒等多种生物活性,目前已经成为发现新的天然活性物质的重要来源。因此,本文选取了植物内生真菌和毛壳属真菌作为研究对象,对其次级代谢产物的分离纯化、鉴定以及生物活性等方面进行了研究。首先,采用组织分离法从13种植物的果实、叶、茎等29个部位中选择性地分离纯化得到了20株内生真菌。运用分子学手段,对20株真菌的28S r DNA序列进行了测定,在BLAST上与其同源性高的序列进行比对,并结合聚类分析和菌落形态颜色的观察,鉴定其中16株内生真菌为Cladosporium sp.,Paramicrothyrium chinensis,Mycosphaerella sp.H41b4,Eupenicillium sp.NF2_PD013,Colletotrichum boninense,Corynespora torulosa,Sarocladium bacillisporum,Colletotrichum sp.,Pestalotiopsis sp.,Guignardia mangiferae,Phoma minor,Pseudocercospora nephrolepidicola,Collembolispora barbata,Alternaria sp.,Corynespora cassiicola和Glomerella acutata;另外3株真菌为Fungal sp.F185(JQ747675.1)、Fungal endophyte(KF435931.1)和Fungus clone Alb_O_Aug F04(GU174372.1),为不常见真菌;还有内生真菌ZSY-1为本实验分离得到的一株新菌株。对分离得到的20株植物内生真菌和购买的5株毛壳属真菌的次级代谢产物情况和表观遗传试剂烟酰胺(NA)和辛二酰二异羟肟酸(SBHA)对其次级代谢产物的影响进行了研究。各个真菌分别在不添加试剂、添加NA 50μmol/L、NA 100μmol/L、SBHA 100μmol/L和SBHA 500μmol/L五种条件下培养。收集得到培养液粗提物,经过高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)分析,结果表明植物内生真菌ZYHY、HGZJ和毛壳属真菌Chaetomium piluliferoides的次级代谢产物非常丰富,表观遗传试剂NA和SBHA对大部分真菌的次级代谢产物合成有影响,其中NA 50μmol/L对菌株HGZJ和Chaetomium piluliferoides的次级代谢产物的影响显著。另外,还初步探究了细菌脂多糖(LPS)对植物内生真菌ZYHY和HGZJ的次级代谢产物的影响,结果表明LPS能明显改变这两株真菌的次级代谢产物谱。运用硅胶柱色谱、薄层色谱、Sephadex LH-20凝胶色谱和HPLC等多种色谱分离技术对菌株ZYHY、HGZJ和Chaetomium piluliferoides的培养液粗提物进行了分离纯化,共分离得到15个化合物,并借助核磁共振(NMR)和MS等波谱手段对其结构进行了鉴定,其中9个为新化合物。从菌株ZYHY的次级代谢产物中分离得到4个已知化合物,分别为geodin,dihydrogeodin,3’-chlorotrypacidin和monochlorosulochrin,均含有氯元素。从菌株HGZJ的次级代谢产物中分离得到5个新化合物HGZJ-1、HGZJ-2、HGZJ-3、HGZJ-5、HGZJ-6和1个已知化合物ambuic acid。从菌株Chaetomium piluliferoides的次级代谢产物中分离得到4个新化合物CPIL-1、CPIL-3、CPIL-4、CPIL-5和1个已知化合物Chaetophenol A。同时,还测定了化合物CPIL-3和CPIL-4的比旋光度,分别为0和-63.5。利用Mosher法和VCD法测定了化合物CPIL-4的绝对构型,其C-2处的绝对构型为S,C-3处的绝对构型为R。对分离得到的化合物进行了抗氧化、抗癌和抗肝损伤等生物活性的初步评定。实验结果表明,化合物geodin和CPIL-3具有明显的DPPH自由基清除能力。化合物geodin,dihydrogeodin,3’-chlorotrypacidin,monochlorosulochrin,CPIL-4和Chaetophenol A对MCF-7细胞有明显的增殖抑制作用;化合物HGZJ-1,HGZJ-2,CPIL-1和CPIL-3对MCF-7细胞有一定的增殖抑制作用。化合物geodin,3’-chlorotrypacidin和Chaetophenol A对Hep G2细胞有明显的增殖抑制作用;化合物dihydrogeodin,monochlorosulochrin,HGZJ-1,HGZJ-2,CPIL-1和CPIL-3对Hep G2细胞有一定的增殖抑制作用;化合物CPIL-4在低浓度时促进Hep G2细胞的增殖,高浓度时抑制Hep G2细胞的增殖。化合物CPIL-5和低浓度的dihydrogeodin,monochlorosulochrin对CCl4造成的肝细胞损伤有一定的保护作用。
【学位单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：Q936

【参考文献】