OsSPX4与OsSPX6调控水稻磷信号和磷平衡的功能研究

发布时间：2017-04-02 09:00

  本文关键词：OsSPX4与OsSPX6调控水稻磷信号和磷平衡的功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：OsPHR2属于MYB家族转录因子,是水稻缺磷响应的中心调控因子,缺磷条件下诱导一系列缺磷信号基因的表达。已有研究报道水稻体内的SPX蛋白能够作为OsPHR2的抑制因子,抑制植物的磷饥饿响应。本研究着重揭示水稻中SPX家族的SPX4和SPX6协同调控水稻的磷信号和磷平衡的机制。研究发现SPX4的转录水平不受外界磷浓度的影响,而SPX6的表达受缺磷诱导且恢复供磷后表达水平迅速回落。SPX6的启动子含有3个P1BS顺式元件,PHR2能与三个位点结合从而直接调控SPX6对不同磷浓度的响应过程。SPX4在植物各个组织都有表达,而SPX6在植物的根中主要在主根和侧根的生长点表达。亚细胞定位实验证明SPX4和SPX6都属于核质共定位蛋白,两者的区别为SPX4在核仁没有定位而SPX6在核仁有明显定位。研究发现SPX4蛋白的C端173-199之间的氨基酸序列对于SPX4的进核是必须的。SPX4蛋白在缺磷条件下加速降解,且根和叶中蛋白降解趋势基本一致,进一步研究证明SPX4的降解主要依赖于植物体内的磷浓度,同时发现SPX4蛋白的稳定性跟C端具有很大的关系。SPX6蛋白行为与SPX4蛋白存在较大差异,叶片SPX6蛋白表现为缺磷降解,根中则受缺磷诱导。超量表达SPX4造成水稻叶片磷浓度显著下降,根中无机磷积累,破坏植物体内的磷平衡,抑制植物生长。SPX6超表达同样也对水稻的生长造成影响,导致叶片的磷浓度下降。SPX4和SPX6的超表达植株还影响了植物的缺磷响应。通过TALEN技术获得了spx4和spx6突变体,分别获得了SPX4蛋白175位点和177-179位点保守氨基酸缺失的突变体,SPX6在SPX结构域的第二个和第三个亚结构域之间81-84位点四个氨基酸缺失的突变体。spx4突变体表现为生长受到抑制,老叶叶尖出现早衰现象,叶片和根中无机磷明显高于野生型,低磷水培苗磷中毒现象消失。spx6突变体同样表现为生长受到抑制,根长变短,老叶叶尖出现早衰现象,叶片和根中无机磷积累。SPX4和SPX6的缺失均能诱导根毛的伸长,可能通过影响植物的系统磷信号部分模拟了PHR2增强表达的表型。通过杂交获得spx4/spx6双突突变体,表型观察结果表明spx4/spx6生长抑制更加明显,叶片积累的无机磷浓度明显高于亲本spx4和spx6突变体,具有加性效应,说明SPX4和SPX6可能协同参与调控水稻的系统磷信号。体外pull-down和酵母双杂(Y2H)实验证明SPX4和SPX6在体外能够直接与PHR2结合,而突变形式的SPX4和SPX6均不能与PHR2直接互作。BiFC和Co-IP实验进一步证明了SPX4和SPX6能够在植物体内和PHR2互作,BiFC实验还反映出SPX4和SPX6能够显著改变PHR2的亚细胞定位,进一步的烟草表皮细胞共定位实验证实了该结论。EMSA结果表明SPX4和SPX6是通过和PHR2的C端(含有MYB结构域和CC结构域)互作导致PHR2失去结合P1BS的能力。双基因过表达遗传材料SPX4-Ov/PHR2-Ov和SPX6-Ov/PHR2-ov的表型分析表明SPX4和SPX6的超表达能够回复PHR-Ov引起的磷超积累和缺磷响应基因的诱导表达,从遗传学上进一步证明了SPX4以及SPX6与PHR2的互作关系,并且根据以上的研究结果提出SPX4和SPX6调控水稻根和地上部的缺磷响应的模型。综上所述,本研究阐述了水稻中两个含有SPX结构域的蛋白SPX4和SPX6在水稻缺磷响应中的功能和分子机制。在正常磷条件下SPX4和SPX6蛋白稳定,两者通过与PHR2互作改变PHR2的亚细胞定位或者在细胞核内直接阻止PHR2结合其顺式元件使植物一系列缺磷响应基因维持在基础水平；当植物处于缺磷条件下,随着植物体内磷浓度的下降,SPX4和SPX6发生降解,释放出的PHR2进入细胞核从而诱导植物的缺磷响应。本研究构建了SPX4和SPX6在水稻地上部和根中缺磷响应的调控模型,使SPX蛋白家族研究更为系统和完整,进一步完善了植物磷信号通路模型,并为开发磷高效吸收利用的植物新品种提供坚实的理论基础。
【关键词】：水稻(Oryza satival L.) SPX4 SPX6 PHR2 磷信号 磷平衡
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 致谢11-12
• 缩略表12-13
• 摘要13-15
• Abstract15-17
• 第一章 文献综述17-31
• 1.1 引言17
• 1.2 酵母PHO通路17-21
• 1.2.1 转录因子Pho4和Pho218-19
• 1.2.2 Pho80-Pho85-Pho81复合物对Pho4的调控19-20
• 1.2.3 酵母磷转运体20-21
• 1.3 植物磷饥饿信号途径21-30
• 13.1 植物磷信号中心调控因子PHR以及其他的转录因子22-24
• 1.3.2 磷信号中的microRNA及其靶基因和非编码RNA24-25
• 1.3.3 植物磷转运体(Phosphate transporter)及其调控25-27
• 1.3.4 SPX结构域的蛋白分类与功能简介27-30
• 1.4 本研究的目的和意义30-31
• 第二章 SPX4和SPX6的组织表达模式和对磷的响应31-50
• 2.1 引言31
• 2.2 材料与方法31-35
• 2.2.1 材料31
• 2.2.2 溶液培养实验31-32
• 2.2.3 水稻根、叶总RNA的提取以及第一链cDNA合成32
• 2.2.4 水稻DNA的提取32-33
• 2.2.5 SPX6自身启动子基因组融合GFP和GUS载体构建33
• 2.2.6 冻融法转化农杆菌和农杆菌介导的水稻转化33
• 2.2.7 RNA原位杂交33-34
• 2.2.8 GUS染色与显微观察34
• 2.2.9 SPX4和SPX6亚细胞定位34
• 2.2.10 EMSA凝胶阻滞34-35
• 2.2.11 水稻总蛋白提取以及Westren Bolt检测35
• 2.2.12 烟草瞬时转化35
• 2.3 结果与分析35-48
• 2.3.1 SPX4和SPX6转录水平的磷响应35-36
• 2.3.2 PHR2直接调控SPX6缺磷诱导36-38
• 2.3.3 不同供磷条件下SPX4蛋白融合GUS组织表达分析38-40
• 2.3.4 OsSPX6基因的表达模式分析40-42
• 2.3.5 SPX4蛋白亚细胞定位分析42-43
• 2.3.6 SPX6蛋白亚细胞定位分析43-45
• 2.3.7 SPX6蛋白水平的磷响应45-46
• 2.3.8 植物体内SPX4蛋白稳定性依赖于磷浓度46-47
• 2.3.9 SPX4蛋白C端影响SPX4蛋白的稳定性47-48
• 2.4 讨论48-50
• 第三章 SPX4、SPX6超表达影响水稻磷平衡和磷响应50-59
• 3.1 引言50
• 3.2 材料与方法50-51
• 3.2.1 材料50
• 3.2.2 SPX6超表达遗传材料发展50
• 3.2.3 水稻的遗传转化和阳性苗筛选50
• 3.2.4 RNA提取以及半定量分析50-51
• 3.2.5 Southern分析51
• 3.3 结果与分析51-58
• 3.3.1 SPX4超表达材料鉴定和水培生理表型及生理分析51-54
• 3.3.2 SPX6超表达材料鉴定和水培生理表型及生理分析54-56
• 3.3.3 SPX4和SPX6超表达对水稻缺磷响应的影响56-58
• 3.4 讨论58-59
• 第四章 spx4和spx6突变影响水稻磷信号和磷平衡59-76
• 4.1 引言59
• 4.2 材料与方法59-65
• 4.2.1 材料59
• 4.2.2 TALEN原理59-60
• 4.2.3 OsSPX4和OsSPX6 TALEN载体构建60-63
• 4.2.4 水稻转基因以及T_0代转基因苗鉴定63-64
• 4.2.5 野生型、spx4、spx6、spx4/spx6和PHR2-Ov根毛观察64
• 4.2.6 野生型、spx4、spx6、spx4/spx6和PHR2-Ov水培处理64
• 4.2.7 spx4和spx6表型回复实验64-65
• 4.3 结果与分析65-75
• 4.3.1 SSA luciferase报告基因检测TALEN序列活性65
• 4.3.2 spx4和spx6突变体的鉴定65-66
• 4.3.3 spx4和spx6突变体水培表型和磷养分分析66-69
• 4.3.4 spx4、spx6、spx4/spx6和PHR2-Ov的根毛观察69-70
• 4.3.5 spx4/spx6双突加性70-74
• 4.3.6 spx4、spx6表型回复实验74-75
• 4.4 讨论75-76
• 第五章 SPX4和SPX6调控磷信号的分子机制与模型76-92
• 5.1 引言76
• 5.2 材料与方法76-78
• 5.2.1 材料76
• 5.2.2 酵母双杂交实验76
• 5.2.3 蛋白原核表达以及体外pulldown实验76-77
• 5.2.4 蛋白免疫共沉淀77
• 5.2.5 双分子荧光互补实验77
• 5.2.6 烟草双荧光瞬时表达实验77-78
• 5.2.7 EMSA凝胶阻滞实验78
• 5.3 结果与分析78-90
• 5.3.1 SPX4和SPX6蛋白和PHR2的体外互作78-80
• 5.3.2 SPX4和SPX6蛋白和PHR2的在植物体内互作80-81
• 5.3.3 SPX4影响PHR2亚细胞定位81-82
• 5.3.4 SPX4和SPX6抑制PHR2的功能82-86
• 5.3.5 OsSPX4和OsSPX6与OsPHR2遗传互作86-88
• 5.3.6 OsSPX4和OsSPX6在水稻缺磷响应中的调控模型88-90
• 5.4 讨论90-92
• 第六章 结论与展望92-94
• 6.1 结论92-93
• 6.2 展望93-94
• 参考文献94-108
• 附录108-117
• 作者简历及博士期间发表的论文117

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1 钟永嘉;OsSPX4与OsSPX6调控水稻磷信号和磷平衡的功能研究[D];浙江大学;2015年

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