河南华溪蟹ShCdMT和ShCuMT的金属结合特性与机理研究

发布时间：2020-11-18 03:42

　　 为了研究河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)特异性结合镉离子(Cadmium,Cd~(2+))的MT亚型(Cd~(2+)specific binding metallothioneins of S.henanense,ShCdMT)、特异性结合铜离子(Copper,Cu~(2+))的MT亚型(Cu~(2+)specific binding metallothioneins of S.henanense,ShCuMT)的金属结合特性,本学位论文首先设计了大肠杆菌(Escherichia coli)菌体内、外实验,研究了含有ShCdMT重组菌体的金属耐受性、斑点生长情况以及对培养基中重金属离子的清除效果;采用圆二色(Circular dichroism,CD)光谱扫描、等温滴定微量热(Isothermal titration calorimetry,ITC)变化实验方法,研究了ShCdMT的金属结合特性。其次,为了进一步了解河南华溪蟹ShCdMT的金属结合能力,综合利用电喷雾飞行质谱(Electrospray ionization mass spectrometry with a time-of-flight analyser,ESI-TOF-MS)、电感耦合等离子体质谱(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)、CD扫描和ITC热变化实验技术与手段,分析了Cd-、Cu-、铅(Lead,Pb~(2+))-和锌(Zinc,Zn~(2+))-ShCdMT的金属结合化学计量数、Zn-ShCdMT与Cd~(2+)、Cu~(2+)和Pb~(2+)的体外交换反应。还有,为了获得ShCuMT蛋白,在克隆得到了shCumt基因cDNA全长之后,利用DNAMAN、MEGA7.0、Bioedit软件,分析了shCumt的核酸和ShCuMT蛋白氨基酸序列、进化树构建并进行了蛋白质多重序列比对;利用EXPASY在线Protparam和SOPMA软件,解析了ShCuMT蛋白的理化性质和二级结构元件,构建了pET-28a-SUMO-shCumt原核表达载体;利用Ni-NTA亲和层析和凝胶层析,纯化得到了ShCuMT蛋白。最后,为了研究ShCuMT的金属结合特性,利用Cd-、Cu-、和Zn-ShCuMT与DTNB的反应、CD光谱扫描、ITC热变化和ESI-TOF-MS实验方法手段,研究了ShCuMT的金属结合特性。结果包括四个方面:1.河南华溪蟹ShCdMT的金属结合特性与对照组相比,含有ShCdMT的重组菌体对Cd~(2+)、Cu~(2+)、Pb~(2+)和Zn~(2+)具有一定的耐受性,对培养基中Cd~(2+)和Pb~(2+)的清除作用呈显著或极显著性降低(P0.05,P0.01)。在大肠杆菌体内合成的Cd-ShCdMT具有致密且稳定的三维折叠结构,在体外,ShCdMT能螯合6个Cd~(2+)、7个Cu~(2+)、6个Pb~(2+)。ShCdMT对金属离子结合的稳定性从高到低的顺序是:Cu-Cd-Pb-Zn-ShCdMT。2.河南华溪蟹ShCdMT与不同金属离子的结合能力在大肠杆菌体内合成的Zn-、Cd-和Pb-ShCdMT复合物的主要组份是:Zn_(15)-ShCdMT、Cd_9-ShCdMT和Pb_5-ShCdMT;Zn-ShCdMT中的Zn~(2+)极易被Cd~(2+)、Cu~(2+)、Pb~(2+)取代,分别形成稳定的Cd-S键、Cu-S键和Pb-S键。Zn-ShCdMT具有与apo-ShCdMT一样的金属结合化学计量数,能配位6个Cd~(2+)、7个Cu~(2+)和6个Pb~(2+);当与Zn-ShCdMT发生交换的Cd~(2+)、Cu~(2+)和Pb~(2+)的数量分别超过6个、7个和6个时,形成的Cd-S键、Cu-S键和Pb-S键的几何结构将发生改变。3.河南华溪蟹shCumt基因的cDNA克隆、生物信息学分析和ShCuMT蛋白的原核表达shCumt基因cDNA全长为198bp,shCumt基因cDNA的核酸序列与相近物种的mt核酸序列具有较高的相似性;ShCuMT蛋白含有65个氨基酸,其中,半胱氨酸(Cysteine,Cys)含量有21个,约占总氨基酸含量的32.3%,含有3个CXC保守基序、2个CCC串联基序、1个CX_5CXC基序、1个CX_3CXC基序和1个CXCX_2C基序,但不含任何芳香族氨基酸。有较高含量的甘氨酸(Glycine,Gly)、赖氨酸(Lysine,Lys)和丝氨酸(Serine,Ser)等小分子量氨基酸,理论分子量约为6293 Da、等电点8.3,ShCuMT蛋白几乎不含有任何二级结构元件,无规则卷曲的比例占87.69%,ShCuMT蛋白中氨基酸序列与相近物种的特异性结合Cu~(2+)的MT亚型(Cu~(2+)specific binding metallothioneins,Cu-MT)或者MT具有较高的相似性,是一种典型的Cu-硫醇(Cu-thioneins)MT蛋白;诱导SUMO-ShCuMT原核表达的最佳IPTG浓度是1mM,诱导表达的最佳时间为8 h,经纯化、酶切获得了较纯的ShCuMT蛋白。4.河南华溪蟹ShCuMT的金属结合特性ShCuMT表现了较强的金属离子结合特性,ShCuMT与Cd~(2+)、Zn~(2+)和Cu~(2+)结合的稳定性由高到低的顺序为:Cu~(2+)Cd~(2+)Zn~(2+)。在酸性条件下,ShCuMT结合Cu~(2+)具有稳定性和唯一性;在大肠杆菌体内合成的Cd-、Cu-和Zn-ShCuMT中的主要组份分别为:Cd_(19)-、Zn_(19)-和Cu_(32)-ShCuMT。体外apo-ShCuMT能够配位6个Cd~(2+)、3个Zn~(2+)和10个Cu~(2+)。在大肠杆菌体内合成的Cd-和Zn-ShCuMT的CD光谱分别在250nm和254 nm处出现了一条高斯(Gaussian)带,Cu-ShCuMT在270 nm处呈现激联耦合条带,在300-320 nm处呈示典型的Cu-thionein特征性吸收条带。综上所述,得出全文结论如下:一是,ShCdMT对Cd~(2+)的结合具有偏好性,属于Cd-Specific MT亚型,具有无脊椎动物MT典型的β/β结构域,能够与二价金属离子形成M_6~Ⅱ-ShCdMT配位模式,对一价金属离子具有较高的亲密性,在生物体内,ShCdMT具有解除Cd~(2+)的毒性和维持Zn~(2+)内稳态的生物学功能作用。二是,体内合成的ShCdMT具有较强的Zn~(2+)积累和Cd~(2+)吸收能力,与apo-ShCdMT类似,Zn-ShCdMT与Cd~(2+)和Pb~(2+)能够形成M_6~Ⅱ-ShCdMT配位模式,与Cu~(2+)形成M_7~Ⅰ-ShCdMT配位模式。在体内,Zn-ShCdMT能够释放Zn~(2+),吸收Cd~(2+)、Cu~(2+)和Pb~(2+),表明Zn-ShCdMT可以介导细胞内Zn~(2+)的转运和解除异质金属离子的毒性作用。三是,shCumt基因cDNA全长为198bp,编码65个氨基酸,Cys含量占32.3%,理论分子量为6293 Da。与其他MT亚型相似,ShCuMT几乎不含任何二级结构元件,等电点呈碱性,氨基酸序列与蓝蟹(Callinectes sapidus)等近源物种具有较高的相似性,进化树推测,ShCuMT是一种典型的Cu-Specific MT亚型。四是,ShCuMT与Cu~(2+)结合能够形成折叠致密、稳定的三维空间结构。与Cu~(2+)的结合具有稳定性、唯一性和高化学计量数,是一种典型的特异性结合Cu~(2+)的MT亚型。虽然ShCuMT表现出较强的金属离子结合特性,但是,当异质金属离子入侵时,ShCuMT可能不会表现出解除异质金属离子毒性的作用,而是专一性地发挥维持Cu~(2+)内稳态的作用,从而保证河南华溪蟹体内呼吸色素血蓝蛋白的正常合成。
【学位单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：X174
【部分图文】：

河南华溪蟹ShCdMT和ShCuMT的金属结合特性与机理研究222.2异源表达ShCdMT的大肠杆菌对Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+的耐受性2.2.1在Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+的培养基中，含ShCdMT的大肠杆菌的生长图2.2是异源表达ShCdMT的大肠杆菌对Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+抵抗性的斑点实验，由图可知，在空白组中，在10-3、10-4、10-5和10-6稀释度下，对照组与含有ShCdMT的实验组中大肠杆菌的菌斑大孝致密度、边缘光滑程度等均相近（图2.2a）；在Cd2+处理组，对照组菌株能够生长至10-4稀释度，然而，实验组菌株能够生长至10-6稀释度，且与对照组相比，菌斑较大、致密度较高、边缘较圆滑（图2.2b）；在Cu2+处理组，对照组与实验组菌株均能生长至10-6稀释度，但是，实验组菌斑的生长状态较佳（图2.2c）；在Pb2+和Zn2+处理组，对照组与实验组菌株生长趋势与Cu2+接近（图2.2d-e），对照组与实验组菌株均能生长至10-6稀释度，但是，对于10-6稀释度菌液，实验组菌斑较对照组生长较好；说明含有ShCdMT的大肠杆菌对Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+均具有抵抗力，这可能是因为在大肠杆菌体内的ShCdMT能够结合Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+，从而，增强了菌体对重金属离子的抵抗能力，然而，与对照组相比，含有ShCdMT大肠杆菌对Cd2+具有较强的抵抗性。图2.2在不同金属离子的培养基中空白组和含ShCdMT大肠杆菌的生长状况(a:空白组；b、c、d和e:在Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+的培养中，对照组和含ShCdMT大肠杆菌的生长状况)Fig.2.2GrowthpatternsofE.coliheterologouslyexpressedandnotexpressedShCdMTtodifferentkindsofmetalions.(a:withoutmetalionsinthemedium.b,c,dande：thegrowthpatternso

第二章河南华溪蟹ShCdMT的金属结合特性研究232.2.2含ShCdMT的大肠杆菌对Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+的耐受性图2.3是异源表达ShCdMT大肠杆菌对Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+的耐受性实验，由图可知，与对照组相比，在0.1mMCd2+和0.5mMPb2+处理组中，异源表达ShCdMT的大肠杆菌的生长较佳（图2.3a和c），然而，在0.3mMCu2+和0.8mMZn2+处理组中，对照组与实验组的生长曲线接近（图2.3b和d），说明异源表达ShCdMT的大肠杆菌对Cd2+和Pb2+具有较强的耐受性，对Cu2+和Zn2+的耐受性不明显。图2.3在Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+的暴露下对照组和异源表达ShCdMT大肠杆菌的生长曲线(a、b、c和d:对照组和异源表达ShCdMT大肠杆菌在Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+暴露下的生长曲线)Fig.2.3ThegrowthcurvesofE.coliheterologouslyexpressedShCdMTwithCd2+,Cu2+,Pb2+andZn2+.(a:thetoleranceofE.coliheterologouslyexpressedShCdMTofCd2+;b,candd:thetoleranceofE.coliheterologouslyexpressedShCdMTtotheCu2+,Pb2+andZn2+.)2.2.3含ShCdMT的大肠杆菌对培养基中Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+的清除作用图2.4是异源表达ShCdMT大肠杆菌对培养基中Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+的清除作用，在0.1mMCd2+和0.5mMPb2+处理组中，在IPTG诱导0h和8h之后，与对照组相比，实验组培养基中Cd2+和Pb2+的浓度呈显著和极显著性降低（P<0.05;P<0.01）；在Cu2+和Zn2+处理组，与对照相比，实验组培养基中Cu2+和Zn2+浓度无显著性变化，说明ShCdMT对培养基中Cd2+和Pb2+具有较高的清除作用。

河南华溪蟹ShCdMT和ShCuMT的金属结合特性与机理研究24由以上实验结果得出：在大肠杆菌体内，ShCdMT能够结合Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+，但是，其对不同金属离子的结合具有差异性，ShCdMT具有较强的Cd2+和Pb2+结合能力。图2.4对照组和异源表达ShCdMT大肠杆菌对培养基中Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+的清除作用(T0和T8分别是指在培养基中添加Cd2+、Cu2+、Pb2+和Zn2+后，IPTG诱导表达的0h和8h。)Fig.2.4ChangesofmetalionconcentrationsinculturemediaofthecontrolandheterologouslyexpressedShCdMTatT0andT8.(T0andT8respectivelyrefertothe0hand8htimepointsafteraddingmetalandIPTG.)2.3体外重构的Cd-、Cu-、Pb-与Zn-ShCdMT的金属结合特性2.3.1体外重构Cd-、Cu-、Pb-和Zn-ShCdMT的光谱学特性利用UV和CD光谱表征了体外重构的Cd-、Cu-、Pb-和Zn-ShCdMT的金属-配体电荷转移特异性紫外吸收带[11]，从而，分析ShCdMT在体外与金属离子的结合特性（图2.5）。由图2.5可知，体外重构的Cd-、Cu-、Pb-和Zn-ShCdMT的UV吸收光谱显示：在254nm处，Cd-ShCdMT显示一个特征性的吸收峰，这一结果与其他物种MT与Cd2+结合后展示的UV特征吸收峰一致（图2.5a）；在250-280nm之间，重构的Cu-ShCdMT展示吸光度的增加，但是，没有显著的肩峰出现（图2.5b）；在250nm和340nm处，重构的Pb-ShCdMT展示两处特征性吸收峰（图2.5c）；然而，在220nm处，重构的Zn-ShCdMT的吸光度显示微弱的增加（图2.5d）；CD光谱显示：在260nm处，重构的Cd-ShCdMT呈现密度较高的Gaussian带[16]（图2.5e），在250nm处，重构的Cu-ShCdMT展示一个密度较低的Gaussian带（图2.5f），同时，在250nm处，重构的Pb-ShCdMT出现一条明显的高斯带（图2.5g），3
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 武阳;马文丽;王兰;;华溪蟹主要组织蛋白质双向电泳技术体系的建立[J];山西大学学报(自然科学版);2011年S2期

2 刘发义,梁德海,孙凤,李荷芳,兰信;饵料中的铜对中国对虾的影响[J];海洋与湖沼;1990年05期

本文编号：2888286