蛋白质复性助剂设计与同电荷介质促进蛋白质复性和集成纯化方法研究

发布时间：2020-11-17 16:30

【摘要】：蛋白质的折叠复性和分离纯化是生产基因重组药物和高附加值基因产品的关键步骤。本文针对蛋白质复性过程的两个关键因素(促进二硫键形成和抑制蛋白质聚集),开展蛋白质复性助剂的研究和蛋白质复性与集成纯化方法的研发。针对二硫键形成问题,从模拟蛋白质二硫键异构酶(PDI)的疏水区域和正电区域出发,设计得到模拟寡肽RKCGCFF。研究表明,与传统氧化剂GSSG和短肽RKCGC相比,RKCGCFF能够更好地提高变性还原溶菌酶氧化复性的速率和收率,且对较高浓度的溶菌酶也具有较好的辅助复性的效果。分析认为,由于RKCGCFF分子中同时引入了疏水区域和正电区域,使其在结构和性质上都更加接近于PDI,因此使其在促进二硫键形成的同时,又具有一定的抑制蛋白质聚集的效果,亦即类似于PDI的分子伴侣功能。针对蛋白质聚集问题,基于前人研究发现的同电荷微球能够有效抑制蛋白质聚集,且其效果与介质的电荷密度正相关的结论,本研究在二氧化硅纳米粒子(SNPs)表面接枝聚乙烯亚胺分子(PEI)并二次修饰2-二乙氨基氯乙基(DEAE),得到一系列高电荷密度以及高比表面积的阳离子纳米颗粒。利用它们辅助带正电荷的溶菌酶的氧化复性的研究表明,高电荷密度的纳米粒子能够在极低的介质添加量时高效辅助同电荷溶菌酶的复性。与PGMA微米球相比,介质用量下降了96%。由此证实,具有高电荷密度和比表面积的纳米介质更适合应用于同电荷介质辅助蛋白质复性的方法中。在上述研究的基础上,针对重组蛋白在复性中的纯化问题,本研究在琼脂糖凝胶介质(Sepharose FF)表面修饰亚氨基二乙酸(IDA),制备得到一种金属螯合介质IDA-Sepharose FF。利用IDA的负电性质和金属螯合性质,建立了一种同电荷辅助复性与集成纯化的方法,用于辅助六聚组氨酸标记的重组增强型绿色荧光蛋白(6×his-EGFP)包含体的复性与纯化。研究表明,IDA-Sepharose FF介质能够快速高效地辅助6×his-EGFP包含体的复性,并且在辅助复性的同时,能够吸附部分杂蛋白,具有初步纯化的效果。特别是在复性之后,通过引入少量镍离子即可实现对6×his-EGFP的特异性吸附,最终得到高收率(85%)以及高纯度(93%)的目标蛋白。进一步采用原子转移自由基聚合(ATRP)接枝方法,制备得到高IDA接枝量的纳米粒子,并且发现具有高电荷密度的金属螯合纳米粒子能够进一步提高6×his-EGFP包含体的复性与纯化效果,体现出其在实际应用中的更大优势。
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q51
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 蛋白质的折叠复性
        1.1.1 蛋白质的结构与活性
        1.1.2 蛋白质的折叠机理
        1.1.3 影响蛋白质折叠复性的关键因素
    1.2 促进蛋白质二硫键形成的方法
        1.2.1 体内促进蛋白质二硫键形成的氧化还原酶
        1.2.2 体外促进蛋白质二硫键形成的小分子氧化还原剂
    1.3 抑制蛋白质聚集的方法
        1.3.1 体内抑制蛋白质聚集的分子伴侣
        1.3.2 体外抑制蛋白质聚集的小分子抑制剂
        1.3.3 色谱复性
        1.3.4 其他抑制聚集的复性方法
    1.4 蛋白质的亲和纯化技术
        1.4.1 亲和纯化的原理
        1.4.2 亲和纯化的种类
        1.4.3 金属螯合亲和纯化
    1.5 本研究的内容及意义
第二章 二硫键异构酶模拟寡肽的设计及其促进蛋白质氧化复性
    2.1 引言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 实验材料
        2.2.2 蛋白质的还原变性
        2.2.3 蛋白质的氧化复性动力学
        2.2.4 蛋白质的酶活测定
        2.2.5 二硫键氧化还原势的测定
        2.2.6 巯醇pKa值的测定
    2.3 实验结果与讨论
        2.3.1 二硫键异构酶模拟寡肽的设计
        2.3.2 不同氧化剂的比较
        2.3.3 较高浓度溶菌酶的复性
    2.4 小结
第三章 高电荷密度的纳米粒子在蛋白质吸附和同电荷蛋白质复性中的应用
    3.1 引言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 二氧化硅纳米粒子表面的电荷修饰
        3.2.3 电荷修饰的纳米粒子的表征
        3.2.4 溶菌酶的变性和复性
        3.2.5 溶菌酶的酶活测定
    3.3 实验结果与讨论
        3.3.1 电荷修饰的纳米粒子的性质表征
        3.3.2 电荷修饰的纳米粒子对BSA的吸附
        3.3.3 电荷修饰的纳米粒子辅助溶菌酶复性
        3.3.4 电荷修饰的纳米粒子与微米球辅助溶菌酶复性效果的比较
    3.4 小结
第四章 同电荷金属螯合介质辅助 6×his-EGFP包含体的复性与集成纯化过程
    4.1 引言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 实验材料
        4.2.2 亚氨基二乙酸修饰的Sepharose FF介质的制备
        4.2.3 IDA-Sepharose FF介质的性质表征
        4.2.4 重组绿色荧光蛋白包含体的制备
        4.2.5 包含体中目标蛋白 6×his-EGFP纯度的测定
        4.2.6 总蛋白质含量的测定
        4.2.7 天然 6×his-EGFP的纯化
        4.2.8 活性 6×his-EGFP的荧光标准曲线测定
        4.2.9 6×his-EGFP的变性和复性
        4.2.10 IDA-Sepharose FF介质的临界金属离子浓度测定
        4.2.11 复性后 6×his-EGFP的金属螯合亲和吸附
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 介质的性质表征
        4.3.2 纯化 6×his-EGFP的复性
        4.3.3 6×his-EGFP的金属螯合亲和吸附
        4.3.4 6×his-EGFP包含体的复性与集成纯化
    4.4 小结
第五章 高电荷密度的金属螯合纳米介质强化 6×his-EGFP包含体的复性与集成纯化
    5.1 引言
    5.2 材料和方法
        5.2.1 实验材料
        5.2.2 ATRP方法制备接枝型纳米粒子SNPs-PGI
        5.2.3 纳米介质SNPs-PGI的性质表征
        5.2.4 天然 6×his-EGFP的纯化和包含体的制备
        5.2.5 6×his-EGFP包含体的变性和复性
        5.2.6 镍离子对复性后 6×his-EGFP包含体的分离纯化
    5.3 实验结果与讨论
        5.3.1 SNPs-PGI的制备和性质表征
        5.3.2 SNPs-PGI的电荷性质和 6×his-EGFP吸附容量
        5.3.3 SNPs-PGI辅助 6×his-EGFP包含体复性
        5.3.4 SNPs-PGI对复性后 6×his-EGFP包含体的纯化
    5.4 小结
第六章 结论与展望
    6.1 结论
    6.2 主要创新点
    6.3 展望
参考文献
附录
发表论文和参加科研情况说明
致谢

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 王继雯;谢宝恩;甄静;周伏忠;陈国参;;重组Hepcidin融合蛋白的氧化复性及活性鉴定[J];生物技术通报;2010年05期

2 唐治华，罗丽华，虞冠华，施凤霞，丁树标，许祥裕;重组人白细胞介素－2在离子色谱分离时的复性[J];生物化学杂志;1996年03期

3 ;[J];;年期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 刘护;蛋白质复性助剂设计与同电荷介质促进蛋白质复性和集成纯化方法研究[D];天津大学;2015年

本文编号：2887703