AHBA阳性菌的分离筛选及其中两株菌的产物挖掘与生物合成研究
发布时间：2020-12-06 16:23
抗生素耐药性问题是全球公共卫生领域当前面临的主要威胁之一,研发与已知抗生素缺少交叉耐药性的新型药物是持续的社会需求。放线菌作为主要的小分子药物来源一直备受到天然产物化学家的青睐,几十年来,尽管放线菌的分离方法并未发生根本性的变革,但放线菌天然产物的研究已经由传统的活性指导为主的发现方式逐渐变革为基因（簇/组）序列指导为主的发现方式,序列指导发现新天然产物使得其生物合成研究的开展变得顺理成章,生物合成研究获得的新知识反过来又可以促进天然产物的理性发现,形成良性循环,有望引起天然产物研究的再次复兴。本论文从土壤放线菌选择性分离与优选、两株高新颖性菌株的基因组挖掘和挖掘产物的生物合成三方面开展了系统的研究。通过放线菌的选择性分离和去重复,我们从来自全国各地的55份土壤样品中分离获得了 779株放线菌,其中稀有放线菌276株,占比35.4%。通过PCR筛选兼具保守性和特异性的AHBA合酶基因,我们共获得了 54株AHBA合酶基因阳性菌（S001-S054）,部分菌株由于保存后未能成功复苏,实际获得AHBA 阳性菌44株。我们从中挑选了 AHBA合酶基因新颖性最高的两株链霉菌S001和S006进...
【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：159 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１．６通过调控基因操纵获得的天然产物??Ｆｉｇｕｒｅ?１．６?Ｎａｔｕｒａｌ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ?ｂｙ?ｏｐｅｒａｔｉｎｇ?ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ?ｇｅｎｅｓ??ｌｌ??
东大学博士学位论文???从汾ｒｅ／＾ｍｙａｓｐ．?ＰＧＡ６４中成功激活并分离了两个蒽醌氨基糖苷类化合物??ｇａｕｄｉｍｙｃｉｎ?Ｄ?和?Ｅ?（图?１．７）。??Ｖｊ；〇??°Ｓ￥〇：〇ｊ６?ｒ％０??—?一Ａ?ｉｎｄｕｃａ副ｅｃ??ｐｉｐｅｒｉｄａｍｙｃｉｎ?Ｆ：?Ｒ，＝?ＣＨ３，?Ｒ２＝?ＣＨ３??ｇａｕｄｉｍｙｃｉｎ?Ｅ?Ｊ，Ｈ??＾?ＩＮｎ２?ｇａｕｄｉｍｙｃｉｎ?Ｄ??ｍｄｕｃａｍｉｄｅ?Ａ：?Ｒ?＝?Ｃｌ??ｉｎｄｕｃａｍｉｄｅ?Ｂ：?Ｒ?＝?Ｈ??图１．７通过突变选择获得的天然产物??Ｆｉｇｕｒｅ?１．７?Ｎａｔｕｒａｌ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ?ｂｙ?ｍｕｔａｎｔｓ?ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ??１．１．５转录因子诱饵策略??动辄几十甚至上百ｋｂ大小的ＰＫＳ／ＮＲＰＳ基因簇，其中可能包含多个操纵子，??涉及到的转录调控比较复杂，因此有时操纵途径特异性调控因子或单个强启动子??置换的策略未必能够有效激活沉默基因簇。Ｗａｎｇ等人最近开发了一种可以在转??录调控层面定向激活沉默基因簇的策略，命名为转录因子诱馆（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ??ｆａｃｔｏｒ?ｄｅｃｏｙ，?ＴＦＤ）策略。ＴＦＤ是一段模拟了调控因子结合ＤＮＡ的序列，在ＴＦＤ??大量存在的情况下，可以竞争性地结合调控因子，使基因簇中调控因子的靶序列??得以释放，从而激活或抑制（根据调控因子正负而分）目标基因簇的表达。为了高??通量地激活目标微生物中的多个沉默基因簇，可以将ＴＦＤ克隆至高拷贝质粒上??的无启动子的卡那霉素抗性基因上游，通过抗性筛选，确定最终用于发酵检测的??突变株。通过ＴＦＤ策略，Ｗａｎｇ等人成功激活了多个链
品。到目前为止，绝大多数的ＦＤＨ属于双组份的卤代酶，即需要ＦＲ作??为辅酶，催化ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ还原Ｆｌａｖｉｎ。只有三个特殊的ＦＤＨ不需要ＦＲ的参与，??作为单组份的ＦＤＨ完成卤代反应。来源于海洋的假交替单胞菌属的Ｂｍｐ５，可??以催化４－羟基苯甲酸生成３－溴－４－羟基苯甲酸，以及催化３－溴－４－羟基苯甲酸的脱??羧溴代反应，生成２，４－二溴苯酚８７，其他两个为该基因的同源基因８８。??？卞，Ｔ??－）〇５ｃ？°??Ｒ?ｒ￥?“ｅｇ?Ｌｙｓｖ?／?趣??ｖｖ－＂Ｌｙ？??图１．１０?ＦＤＨ的催化机制．（Ａ）?ＦＤＨ催化卤代反应过程中异咯嗪环中的氧化还原反应；（Ｂ）??ＦＤＨ?Ｂｍｐ２?（ＰＤＢ：?５ＢＶＡ）中黄素辅因子中异咯嗪环与ＦＤＨ卤代活性赖氨酸的相对位置??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１０?Ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ＦＤＨ．?（Ａ）?Ｒｅｄｏｘ?ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｉｓｏａｌｌｏｘａｚｉｎｅ?ｄｕｒｉｎｇ??ｈａｌｏｇｅｎａｔｉｏｎ?ｃａｔａｌｙｚｅｄ?ｂｙ?ＦＤＨ；?（Ｂ）?Ｒｅｌａｔｉｖｅ?ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ?ｏｆ?ｆｌａｖｉｎ?ｃｏｆａｃｔｏｒ?ｉｓｏａｌｌｏｘａｚｉｎｅ?ａｎｄ?ｔｈｅ??ＦＤＨ?Ｂｍｐ２（ＰＤＢ：?５ＢＶＡ）?ｃａｔａｌｙｔｉｃ?ｌｙｓｉｎｅ?ｓｉｄｅ?ｃｈａｉｎ．??１．２．２催化游离底物卤代的黄素依赖的卤代酶研究??到目前为止，对于游离底物的卤代酶的研究主要来源于细菌的色氨酸氯代酶。??对于色氨酸的氯代反应可以发生在色氨酸苯环的５，６，７位８９?（图１．１１）。来自抗真??菌天然产物比洛尼群（ｐｙｒｒｏｌｎｉｔｒｉｎ）生物合成基因簇的色氨酸－７位氯代酶ＰｍＡ是??
【参考文献】：
期刊论文
[1]超声波处理土样分离放线菌[J]. 姜怡,曹艳茹,赵立兴,王茜,靳荣线,和文祥,薛泉宏. 微生物学报. 2010(08)
本文编号：2901680
【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：159 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１．６通过调控基因操纵获得的天然产物??Ｆｉｇｕｒｅ?１．６?Ｎａｔｕｒａｌ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ?ｂｙ?ｏｐｅｒａｔｉｎｇ?ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ?ｇｅｎｅｓ??ｌｌ??
东大学博士学位论文???从汾ｒｅ／＾ｍｙａｓｐ．?ＰＧＡ６４中成功激活并分离了两个蒽醌氨基糖苷类化合物??ｇａｕｄｉｍｙｃｉｎ?Ｄ?和?Ｅ?（图?１．７）。??Ｖｊ；〇??°Ｓ￥〇：〇ｊ６?ｒ％０??—?一Ａ?ｉｎｄｕｃａ副ｅｃ??ｐｉｐｅｒｉｄａｍｙｃｉｎ?Ｆ：?Ｒ，＝?ＣＨ３，?Ｒ２＝?ＣＨ３??ｇａｕｄｉｍｙｃｉｎ?Ｅ?Ｊ，Ｈ??＾?ＩＮｎ２?ｇａｕｄｉｍｙｃｉｎ?Ｄ??ｍｄｕｃａｍｉｄｅ?Ａ：?Ｒ?＝?Ｃｌ??ｉｎｄｕｃａｍｉｄｅ?Ｂ：?Ｒ?＝?Ｈ??图１．７通过突变选择获得的天然产物??Ｆｉｇｕｒｅ?１．７?Ｎａｔｕｒａｌ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ?ｂｙ?ｍｕｔａｎｔｓ?ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ??１．１．５转录因子诱饵策略??动辄几十甚至上百ｋｂ大小的ＰＫＳ／ＮＲＰＳ基因簇，其中可能包含多个操纵子，??涉及到的转录调控比较复杂，因此有时操纵途径特异性调控因子或单个强启动子??置换的策略未必能够有效激活沉默基因簇。Ｗａｎｇ等人最近开发了一种可以在转??录调控层面定向激活沉默基因簇的策略，命名为转录因子诱馆（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ??ｆａｃｔｏｒ?ｄｅｃｏｙ，?ＴＦＤ）策略。ＴＦＤ是一段模拟了调控因子结合ＤＮＡ的序列，在ＴＦＤ??大量存在的情况下，可以竞争性地结合调控因子，使基因簇中调控因子的靶序列??得以释放，从而激活或抑制（根据调控因子正负而分）目标基因簇的表达。为了高??通量地激活目标微生物中的多个沉默基因簇，可以将ＴＦＤ克隆至高拷贝质粒上??的无启动子的卡那霉素抗性基因上游，通过抗性筛选，确定最终用于发酵检测的??突变株。通过ＴＦＤ策略，Ｗａｎｇ等人成功激活了多个链
品。到目前为止，绝大多数的ＦＤＨ属于双组份的卤代酶，即需要ＦＲ作??为辅酶，催化ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ还原Ｆｌａｖｉｎ。只有三个特殊的ＦＤＨ不需要ＦＲ的参与，??作为单组份的ＦＤＨ完成卤代反应。来源于海洋的假交替单胞菌属的Ｂｍｐ５，可??以催化４－羟基苯甲酸生成３－溴－４－羟基苯甲酸，以及催化３－溴－４－羟基苯甲酸的脱??羧溴代反应，生成２，４－二溴苯酚８７，其他两个为该基因的同源基因８８。??？卞，Ｔ??－）〇５ｃ？°??Ｒ?ｒ￥?“ｅｇ?Ｌｙｓｖ?／?趣??ｖｖ－＂Ｌｙ？??图１．１０?ＦＤＨ的催化机制．（Ａ）?ＦＤＨ催化卤代反应过程中异咯嗪环中的氧化还原反应；（Ｂ）??ＦＤＨ?Ｂｍｐ２?（ＰＤＢ：?５ＢＶＡ）中黄素辅因子中异咯嗪环与ＦＤＨ卤代活性赖氨酸的相对位置??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１０?Ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ＦＤＨ．?（Ａ）?Ｒｅｄｏｘ?ｒｅａｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｉｓｏａｌｌｏｘａｚｉｎｅ?ｄｕｒｉｎｇ??ｈａｌｏｇｅｎａｔｉｏｎ?ｃａｔａｌｙｚｅｄ?ｂｙ?ＦＤＨ；?（Ｂ）?Ｒｅｌａｔｉｖｅ?ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ?ｏｆ?ｆｌａｖｉｎ?ｃｏｆａｃｔｏｒ?ｉｓｏａｌｌｏｘａｚｉｎｅ?ａｎｄ?ｔｈｅ??ＦＤＨ?Ｂｍｐ２（ＰＤＢ：?５ＢＶＡ）?ｃａｔａｌｙｔｉｃ?ｌｙｓｉｎｅ?ｓｉｄｅ?ｃｈａｉｎ．??１．２．２催化游离底物卤代的黄素依赖的卤代酶研究??到目前为止，对于游离底物的卤代酶的研究主要来源于细菌的色氨酸氯代酶。??对于色氨酸的氯代反应可以发生在色氨酸苯环的５，６，７位８９?（图１．１１）。来自抗真??菌天然产物比洛尼群（ｐｙｒｒｏｌｎｉｔｒｉｎ）生物合成基因簇的色氨酸－７位氯代酶ＰｍＡ是??
【参考文献】：
期刊论文
[1]超声波处理土样分离放线菌[J]. 姜怡,曹艳茹,赵立兴,王茜,靳荣线,和文祥,薛泉宏. 微生物学报. 2010(08)
本文编号：2901680
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