树皮栖生黏菌物种多样性和黏菌分子系统学的研究

发布时间：2017-04-10 23:41

  本文关键词：树皮栖生黏菌物种多样性和黏菌分子系统学的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：树皮栖生黏菌是一独特的类群,通过树皮基物的湿室培养法获得的小型黏菌种可以丰富黏菌的物种多样性。黏菌物种多样性的研究主要集中在温带和热带地区,为了探讨全球地区黏菌物种多样性的分布格局,有必要进行亚热带森林中树皮栖生黏菌物种多样性的研究。在中国东部亚热带地区的天目山国家自然保护区根据林型设置4个样地(常绿阔叶林、常绿落叶阔叶混交林、落叶阔叶林和针叶林),每个样地设置5个样点,每个样点选取4棵树,每棵树选取距地面50 cm与150 cm处的采样高度。于2011年10月、2012年5月和2012年10月进行3次野外调查,共采集380份树皮基物,1440个平皿湿室培养,每一平皿培养2个月。在1440个平皿中1139个阳性平皿(79%)产生原生质团和子实体,共获得20属42种树皮栖生黏菌,其中8种树皮栖生黏菌为丰富种：圆头发菌Comatricha elegans (12.82%)、混淆筛菌Cribraria confusa (12.82%).小无丝菌Licea pusilla (10.97%)、小筛菌Cribraria microcarpa(9.31%)、弧线颈环菌Collaria arcyrionema(7.46%)、两瓣无丝菌Licea biforis(7.11%)、灰团网菌Arcyria cinerea (6.23%)和碎皮菌Clastoderma debaryanum (4.13%)。在4种林型中,落叶阔叶林中树皮栖生黏菌的物种丰富度和物种多样性最高(S=33,exp[H']=16.60, S/G=1.74),针叶林中树皮栖生黏菌的物种丰富度最低且物种组成最均匀(S=21,J'=0.91),常绿落叶阔叶混交林与常绿阔叶林的树皮栖生黏菌的物种组成最相似,与落叶阔叶林的物种组成差异最大。等级聚类分析和多维标度排序表明树皮栖生黏菌的物种组成呈季节性分布：2011年10月树皮获得的树皮栖生黏菌物种为一类群,2012年5月的树皮栖生黏菌物种为一类群,2012年10月的树皮栖生黏菌物种为一类群,其中2012年5月和2012年10月的黏菌物种组成最相似。典范对应分析结果表明采样季节和树皮pH对黏菌分布的影响极其显著,发网菌目、团毛菌目和无丝菌目黏菌偏好较酸的环境。DNA条形码技术是一种快速、精确和自动化的物种鉴定方法,有必要进行黏菌DNA条形码的研究。研究选取核糖体小亚基(Small subunit ribosomal RNA, SSU rRNA)、线粒体细胞色素c氧化酶亚基1(Cytochrome c oxidase subunit 1, COI)、翻译延长因子la (Elongation factors-1 alpha, EF-1α)、核糖体内转录间隔区(Internal transcribed spacer, ITS)及ITS1、ITS2区为供试基因片段,结合GenBank中的相关序列共5目19种144个序列,利用序列的扩增测序获得率、序列间的差异及构建系统树的方法评价黏菌的备选DNA条形码,分析结果表明SSU rRNA基因5'端V1和V2区大小为600 bp左右的片段可作为黏菌的备选DNA条形码。在备选基因片段中,多数黏菌的COI基因序列在转录过程中需要插入或替换碱基,且每种黏菌的碱基插入位点不同,要获得精确完整的COI cDNA序列需要较高的经济条件,因此CO1基因序列不适宜作为黏菌的DNA条形码。EF-1a基因片段的信息位点有限和密码子第三位的变异性,导致物种鉴定率低,EF-1a基因片段同样不适宜作为黏菌的备选DNA条形码。ITS序列及ITS1、ITS2区仅在绒泡菌目中扩增成功,需要设计多对引物扩增获得其他目的ITS序列,ITS序列的组成和大小差异较大(分别为826～1495 bp, 174～786 bp,498～696 bp),因此ITS序列及ITS1、ITS2区也不适宜作为黏菌的DNA条形码。SSU rRNA基因片段(5'端V1和V2区大小为600 bp左右)在黏菌供试种中的获得率为100%,其对供试种的鉴定效率明显优于其他供试基因,该片段不失为一个较好的黏菌备选DNA条形码。现代黏菌系统发育学研究主要集中在SSU rRNA和EF-1a基因上,为了扩充黏菌系统发育研究的基因资源,结合COI和SSU rRNA基因序列共同比较分析黏菌纲目级水平的系统发育关系。论文共获得20个序列,COI和SSU rRNA基因序列各10个,在此之前GenBank中仅有6个黏菌COI基因序列。基于16种COI和16种SSUrRNA基因序列分别单独和共同构建的系统树表明：无丝菌目和团毛菌目亲缘关系近,位于系统发育树的基部,呈并行的两条分支演化路线；刺轴菌目位于发网菌目和绒泡菌目的基部,发网菌目和绒泡菌目的亲缘关系近。由于COI基因序列的保守性和特殊性,COI基因序列不能反映绒泡菌目和发网菌目内部物种之间的系统发育关系。ITS2基因的二级结构比一级结构更为保守,已在多种生物中被证明可用于系统发育关系的研究。结合ITS2和SSU rRNA基因序列,利用新获得的和GenBank中的共56个ITS2序列(44种)和39个SSU rRNA序列(28种)构建系统发育树探讨ITS2基因用于黏菌系统发育研究的可行性。ITS2区将无丝菌目、团毛菌目和发网菌目聚为同一分支,三者为绒泡菌目的姐妹群；ITS2区不能较好的揭示团毛菌目和无丝菌目内部物种间的亲缘关系。因此,由于ITS2序列的变异性和有限性,ITS2区在推断黏菌高阶元系统发育关系时并不是一个较好的分子标记。相反SSU rRNA基因可以很好的揭示黏菌的系统发育关系。ITS2的二级结构能够反映鳞钙皮菌Didymium squmulosum为形态学相近的复合类群。
【关键词】：黏菌 物种分类 物种鉴定 DNA条形码 系统发育
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q949.32
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 符号说明11-12
• 第一章 绪论12-31
• 1 黏菌物种多样性的研究12-17
• 1.1 黏菌的分布13
• 1.2 黏菌生长的基物特异性13-14
• 1.3 树皮栖生黏菌的概念14
• 1.4 影响黏菌物种组成的环境因素14-17
• 2 生物群落物种多样性的研究方法17-19
• 2.1 生物群落的物种累积曲线绘制17-18
• 2.2 生物群落的多样性测度18
• 2.3 生物群落的等级聚类分析和多维标度排序18
• 2.4 生物群落的相似性分析检验18-19
• 2.5 生物群落的典范对应分析19
• 3 黏菌分子系统学的研究现状19-30
• 3.1 分子系统学的概念19-21
• 3.2 DNA条形码的研究现状21-24
• 3.3 黏菌系统发育的研究现状24-29
• 3.4 黏菌分子系统学研究存在的问题与展望29-30
• 4 本文研究的内容、目的和意义30-31
• 4.1 研究内容30
• 4.2 研究目的30
• 4.3 研究意义30-31
• 第二章 天目山国家自然保护区树皮栖生黏菌物种多样性的研究31-50
• 1 前言31
• 2 材料与方法31-36
• 2.1 实验所用仪器31-32
• 2.2 样地设置32
• 2.3 采样方法32-33
• 2.4 树皮的湿室培养33
• 2.5 树皮栖生黏菌的物种鉴定33-34
• 2.6 数据处理34-36
• 3 结果36-46
• 3.1 树皮栖生黏菌的物种组成36-37
• 3.2 采样方法的充分性估计37-40
• 3.3 树皮生栖生黏菌的物种多样性分析40-41
• 3.4 树皮栖生黏菌的群落分析41-46
• 4 讨论46-49
• 5 小结49-50
• 第三章 黏菌DNA条形码的初步探索50-73
• 1 前言50-51
• 2 材料与方法51-60
• 2.1 实验材料51
• 2.2 实验试剂与仪器51-54
• 2.3 基因组DNA的提取54-55
• 2.4 引物的选择、设计和确定55-56
• 2.5 目的片段的扩增56
• 2.6 PCR产物的检测56-57
• 2.7 PCR产物的纯化57
• 2.8 PCR产物的克隆与测序57-58
• 2.9 序列编辑58
• 2.10 候选DNA条形码序列的数据分析58-60
• 3 结果60-68
• 3.1 PCR反应的适宜条件60
• 3.2 PCR扩增测序结果60
• 3.3 PCR扩增和测序成功率60-62
• 3.4 种内与种间的遗传距离62-63
• 3.5 基因序列在种内与种间的相似性差异63
• 3.6 DNA Barcoding Gap的鉴定63-64
• 3.7 系统发育关系的评价鉴定效率64-68
• 4 讨论68-71
• 5 小结71-73
• 第四章 COI和SSU rRNA基因用于黏菌系统发育研究的比较分析73-83
• 1 前言73-74
• 2 材料与方法74-75
• 2.1 实验材料74
• 2.2 实验试剂与仪器74
• 2.3 基因组DNA的提取74
• 2.4 PCR扩增和测序74
• 2.5 序列比对74
• 2.6 序列碱基组成分析74
• 2.7 数据组系统发育信号检测74
• 2.8 COI和SSU rRNA基因系统发育树的构建74-75
• 3 结果75-80
• 3.1 COI和SSU rRNA基因序列的碱基组成75-76
• 3.2 COI和SSU rRNA基因序列的遗传距离76
• 3.3 COI和SSU rRNA基因序列的碱基替换饱和性分析76-77
• 3.4 COI和SSU rRNA基因序列构建的黏菌纲内系统发育树77-80
• 4 讨论80-82
• 5 小结82-83
• 第五章 评估ITS2基因用于黏菌系统发育研究的可行性83-90
• 1 前言83
• 2 材料与方法83
• 2.1 ITS2序列的获得83
• 2.2 ITS2序列RNA二级结构的构建83
• 2.3 ITS2和SSU rRNA基因系统发育树的构建83
• 3 结果83-87
• 3.1 ITS2 RNA二级结构83-84
• 3.2 ITS2基因序列构建的黏菌纲内系统发育树84
• 3.3 SSU rRNA基因序列构建的黏菌纲内系统发育树84-87
• 4 讨论87-89
• 5 小结89-90
• 全文总结90-92
• 参考文献92-109
• 附录 A109-114
• 附录 B114-118
• 在读期间发表的学术论文及研究成果118-119
• 致谢119

【参考文献】

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本文编号：297820