TALEN介导的β-乳球蛋白基因敲除奶山羊的生产

发布时间：2017-04-20 04:17

  本文关键词：TALEN介导的β-乳球蛋白基因敲除奶山羊的生产，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)是羊乳中引起婴幼儿乳过敏症的主要过敏原之一。目前多采用生物化学方法对β-乳球蛋白进行加工处理以降低其致敏性,但并不能从根本上解决其致敏问题。靶向基因编辑技术和转基因动物技术的发展为从根本上彻底消除乳汁中的β-乳球蛋白提供了可能。研究表明,TALEN介导的基因打靶可以在生物基因组特定位点进行精确的基因插入或删除。本研究通过构建以山羊BLG基因第一外显子为靶位点的TALENs表达载体及基因打靶载体,在山羊胎儿成纤维细胞中利用TALEN介导的基因打靶技术对BLG基因进行敲除,利用体细胞克隆技术生产BLG基因单敲除奶山羊;并通过在山羊体细胞中进行连续的基因打靶获得BLG基因双敲除奶山羊。研究内容如下:1.靶向山羊BLG基因TALENs表达载体的构建使用“TAL Effector-Nucleotide Targeter”筛选TALENs靶位点,利用单元组装法构建TALEN表达载体,构建双荧光报告载体,将TALEN表达载体与报告载体共同转染HEK293细胞验证其生物活性。结果显示:以山羊BLG基因第一外显子序列为靶位点,利用单元组装法构建TALEN表达载体p TSBE1-R和p TRBE1-L,构建双荧光报告载体p RFP-BE1-GFP,双荧光报告系统检测结果表明单元组装法构建的TALENs表达载体可特异性识别并切割其对应靶位点。2.山羊BLG基因打靶载体的构建以西农莎能奶山羊基因组DNA为模板分别克隆不同大小的同源臂序列,分别构建3个靶向BLG基因的置换型基因敲除载体p BLG-neo、p BLG-neo-M和p BLG-puro。结果显示:以ploxpⅡ为骨架载体构建的p BLG-neo和p BLG-neo-M均含有新霉素抗性筛选标记,其中p BLG-neo的5’和3’同源臂大小分别为1.1 kb和5.3 kb;p BLG-neo-M的5’和3’同源臂大小分别为1.1 kb和1.3 kb。p BLG-puro含有绿色荧光蛋白和嘌呤霉素抗性基因作为双阳性筛选标记,其5’和3’同源臂大小均为1.0 kb。3.山羊胎儿成纤维细胞中BLG基因打靶效率的检测将TALEN表达载体的质粒DNA或以其为模板体外转录制备的m RNAs电穿孔法转染山羊胎儿成纤维细胞(goat fetal fibroblasts,GFFs),使用有限稀释法获取单细胞克隆,经PCR、测序鉴定检测TALENs介导的非同源末端连接修复引起的BLG基因修饰效率;将基因打靶载体p BLG-neo和p BLG-neo-M分别转染GFFs,经药物筛选后,使用PCR鉴定检测自然发生的同源重组介导的基因打靶效率;将TALENs的DNA或m RNAs与p BLG-neo或p BLG-neo-M共转GFFs,经药物筛选后,使用PCR鉴定检测TALEN介导的基因打靶效率。结果显示:将TALENs电转染GFFs,有限稀释法获得303个单细胞克隆,经PCR、测序鉴定,并未发现BLG基因修饰突变体。仅转染基因打靶载体至GFFs,共获得G418抗性克隆1005个,经过PCR鉴定未发现基因打靶细胞。将TALENs与不同的打靶载体共转GFFs,经药物筛选和PCR鉴定,均获得了打靶载体中PGK-neo片段定点整合至山羊BLG基因座的细胞克隆;另外发现,必须同时进行5’端和3’端的PCR鉴定才能保证基因打靶鉴定的准确性经过两轮5’端和3’端的PCR鉴定,TALENs DNA与p BLG-neo-M共转GFFs获得的598个G418抗性克隆中,有94个发生了基因打靶,效率为13.6%;TALENs m RNA与p BLG-neo-M共转GFFs获得的459个G418抗性克隆,有49个发生了基因打靶,效率为10.7%。另外发现,将TALENs质粒DNA转染GFFs,会发生TALENs表达载体在山羊基因组中的随机整合。4.体细胞核移植生产BLG基因单敲除山羊以TALEN m RNAs介导的基因打靶细胞为核供体细胞进行核移植和胚胎移植生产克隆羊,并对出生后代进行PCR、测序及Southern blot鉴定。结果显示:以BLG基因单敲除细胞为核供体共构建克隆胚胎1128枚,出生并存活克隆羊7只,经PCR、Southern blot鉴定,其均为BLG基因单敲除山羊;经测序比对鉴定,BLG基因第一外显子信号肽序列后的20 bp序列被删除,置换为打靶载体p BLG-neo中1935 bp的外源基因。5.BLG基因双敲除山羊的生产取BLG基因单敲除(BLG+/-)山羊耳组织分离得到BLG+/-成体成纤维细胞,以p BLG-puro为打靶载体,在BLG+/-细胞中进行TALEN介导的二次基因打靶,经过嘌呤霉素筛选与PCR鉴定,检测对BLG的另一等位基因的敲除效率;以TALENs m RNA介导的BLG基因双敲除(BLG-/-)细胞作为核供体进行核移植及胚胎移植生产克隆羊,并对出生后代进行PCR、测序及Southern blot鉴定。结果显示:将TALENs质粒DNA与打靶载体p BLG-puro共转BLG+/-细胞,共获得嘌呤霉素抗性克隆667个,经5’端和3’端PCR鉴定后,打靶阳性克隆为39个(5.85%);将TALENs m RNA与打靶载体p BLG-puro共转BLG+/-细胞,共获得嘌呤霉素抗性克隆647个,经5’端和3’端PCR鉴定后,打靶阳性克隆为33个(5.10%);对PCR鉴定阳性的克隆进行Southern blot鉴定,所有克隆均显示为BLG基因双等位基因发生打靶。共构建克隆胚805个,获得克隆山羊3只,经PCR、Southern blot鉴定,其均为BLG基因双敲除山羊。综上所述,本研究建立了利用TALEN介导的基因打靶在动物体细胞中进行基因敲除的技术体系,并通过体细胞克隆分别获得BLG基因单敲除奶山羊7只,BLG基因双敲除奶山羊3只,为β-乳球蛋白敲除奶山羊的新品种培育提供了材料,为研究β-乳球蛋白功能以及以BLG基因座作为靶位点研制乳腺生物反应器奠定基础。
【关键词】：TALEN β-乳球蛋白 奶山羊 基因打靶 同源重组
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;S827
【目录】：

• 摘要6-8
• abstract8-15
• 文献综述15-39
• 第一章 β-乳球蛋白研究进展15-20
• 1.1 β-乳球蛋白结构15-16
• 1.2 β-乳球蛋白的生物功能16-17
• 1.3 β-乳球蛋白致敏性研究及其解决方法17-20
• 1.3.1 β-乳球蛋白的致敏性17-18
• 1.3.2 β-乳球蛋白的致敏性的降低与消除18-20
• 第二章 人工核酸酶在家畜靶向基因组编辑研究中的应用20-39
• 2.1 DNA双链断裂修复机制20-25
• 2.1.1 非同源末端连接修复途径20-21
• 2.1.2 同源重组修复途径21-24
• 2.1.3 修复途径的选择调控24
• 2.1.4 双链断裂修复时NHEJ和HR的合作24-25
• 2.2 人工核酸内切酶25-33
• 2.2.1 锌指核酸酶25-27
• 2.2.2 类转录激活因子效应物核酸酶27-31
• 2.2.3 CRISPR/Cas931-33
• 2.3 人工核酸酶介导的NHEJ修复在家畜靶向基因组编辑中的应用33-38
• 2.4 人工核酸酶介导的HR修复在家畜靶向基因组编辑中的应用38-39
• 试验研究39-93
• 第三章 靶向山羊BLG基因的TALENs表达载体的构建39-50
• 3.1 试验材料39-40
• 3.1.1 菌株、质粒和细胞株39
• 3.1.2 主要试剂39-40
• 3.1.3 测试化验加工40
• 3.2 试验方法40-42
• 3.2.1 单元组装法构建TALENs表达载体40-41
• 3.2.2 TALENs的生物活性验证41-42
• 3.3 结果42-48
• 3.3.1 以山羊BLG基因为靶位点的TALENs表达载体的构建42-46
• 3.3.2 双荧光报告系统验证TALENs的生物活性46-48
• 3.4 讨论48-49
• 3.5 小结49-50
• 第四章 山羊BLG基因打靶载体的构建50-59
• 4.1 试验材料50-51
• 4.1.1 血液样本50
• 4.1.2 菌株和质粒50
• 4.1.3 主要试剂50-51
• 4.1.4 测试化验加工51
• 4.2 试验方法51-53
• 4.2.1 山羊BLG基因打靶载体pBLG-neo-M的构建51-52
• 4.2.2 山羊BLG基因打靶载体pBLG-neo的构建52-53
• 4.2.3 山羊BLG基因打靶载体pBLG-puro的构建53
• 4.3 结果53-57
• 4.3.1 基因打靶载体pBLG-neo和pBLG-neo-M的构建53-55
• 4.3.2 基因打靶载体pBLG-puro的构建55-57
• 4.4 讨论57-58
• 4.5 小结58-59
• 第五章 山羊体细胞中TALEN介导的基因打靶效率检测59-73
• 5.1 试验材料59-60
• 5.1.1 动物组织59
• 5.1.2 主要试剂59-60
• 5.1.3 测试化验加工60
• 5.2 试验方法60-65
• 5.2.1 西农莎能奶山羊胎儿成纤维细胞的培养与性别鉴定60-61
• 5.2.2 山羊胎儿成纤维细胞中TALEN介导的NHEJ引起的BLG基因修饰61-62
• 5.2.3 山羊胎儿成纤维细胞中TALEN介导的山羊BLG基因打靶效率62-65
• 5.3 结果65-69
• 5.3.1 山羊胎儿成纤维细胞的培养与性别鉴定65
• 5.3.2 山羊胎儿成纤维细胞中山TALEN介导的NHEJ引起的BLG基因修饰检测65-66
• 5.3.3 山羊胎儿成纤维细胞中TALENs介导的BLG基因打靶效率检测66-69
• 5.4 讨论69-71
• 5.5 小结71-73
• 第六章 体细胞核移植生产BLG基因单敲除奶山羊73-82
• 6.1 试验材料73-74
• 6.1.1 实验动物73
• 6.1.2 主要试剂73-74
• 6.1.3 测试化验加工74
• 6.2 试验方法74-76
• 6.2.1 体细胞核移植及胚胎移植74-75
• 6.2.2 转基因山羊PCR和Southern鉴定75-76
• 6.3 结果76-79
• 6.3.1 基因打靶细胞的体细胞核移植及效率检测76-78
• 6.3.2 转基因山羊PCR和Southern鉴定78-79
• 6.4 讨论79-81
• 6.5 小结81-82
• 第七章BLG基因双敲除奶山羊的生产82-93
• 7.1 试验材料82-83
• 7.1.1 实验动物82
• 7.1.2 质粒和菌株82
• 7.1.3 主要试剂82-83
• 7.1.4 测试化验加工83
• 7.2 试验方法83-85
• 7.2.1 BLG基因单敲除成体成纤维细胞的培养83
• 7.2.2 二次基因打靶效率的检测83-84
• 7.2.3 BLG基因双敲除山羊的生产及鉴定84-85
• 7.3 结果85-90
• 7.3.1 BLG基因单敲除成体成纤维细胞的培养85
• 7.3.2 二次基因打靶效率的检测85-88
• 7.3.3 BLG基因双敲除山羊的生产88-90
• 7.4 讨论90-92
• 7.5 小结92-93
• 结论93-94
• 创新之处与进一步研究的课题94-95
• 参考文献95-112
• 附录 主要仪器112-114
• 缩略词114-115
• 致谢115-116
• 作者简介116

【参考文献】

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1 BAO Lei;CHEN HaiDe;JONG UiMyong;RIM CholHo;LI WenLing;LIN XiJuan;ZHANG Dan;LUO Qiong;CUI Chun;HUANG HeFeng;ZHANG Yan;XIAO Lei;FU ZhiXin;;Generation of GGTA1 biallelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and somatic cell nuclear transfer[J];Science China(Life Sciences);2014年02期

2 曹随忠;岳成鹤;李西睿;冯冲;龙川;潘登科;;锌指核酸酶技术制备肌肉生长抑制素基因敲除的五指山小型猪成纤维细胞[J];遗传;2013年06期

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本文编号：317898