PKC诱导红细胞锚蛋白外翻诱发的巨噬细胞噬红细胞作用

发布时间：2017-04-20 08:00

  本文关键词：PKC诱导红细胞锚蛋白外翻诱发的巨噬细胞噬红细胞作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人红细胞的平均寿命为100~120天,正常人体内大约存在3×1013个红细胞。每天,有超过2×1011个红细胞被替换。红细胞在体内经历成熟、衰老,最终被脾、肝、骨髓等处的巨噬细胞吞噬、分解。而且老化或者疾病的红细胞往往呈现较弱的细胞形变以及形变恢复能力,使之易于被脾脏滞留,从而被吞噬细胞吞噬以及消化。巨噬细胞对凋亡细胞的识别主要通过其表面的受体来进行的。成熟哺乳动物的红细胞没有细胞核以及细胞器等,红细胞膜的异常(如带3蛋白交联,锚蛋白外翻)触发了巨噬细胞表面的受体分子与其识别,接着黏附、吞噬和分解。然而,膜蛋白的异常导致的红细胞过早清除或者凋亡障碍与多种血液疾病相关,如膜蛋白缺陷、阿尔茨海默症以及高原红细胞增多症。同样在血液保存中,膜蛋白的异常与否往往与血液保存时间的长短有关。探其根源,红细胞膜蛋白的异常以及红细胞程序性死亡与红细胞胞内的PKC激活密切相关。因此,本文通过PMA激活红细胞胞内的PKC,从而探讨激活的PKC与红细胞锚蛋白外翻的关系以及诱导红细胞锚蛋白外翻的机制问题,也进一步探索了激活的PKC诱导红细胞膜骨架结合亲和力的变化与红细胞形变能力的相关关系。希望为深入了解红细胞膜蛋白的结构以及治疗膜蛋白异常的相关血液疾病,同时也对研究人工红细胞的膜骨架蛋白与红细胞变形性能、血液保存过程中血液保存时间的延长等提供细胞和分子层面的探索机理。红细胞锚蛋白为膜内在蛋白,只有当锚蛋白外翻到细胞膜的外侧且锚蛋白RGD序列端也暴露在细胞表面时,巨噬细胞表面的受体分子整合素αvβ3才能与之识别、黏附和吞噬。本研究论文通过PMA激活红细胞胞内的PKC来判断与红细胞程序性死亡紧密相关的胞内PKC的激活能否诱导红细胞锚蛋白的外翻。结果表明,激活的PKC能够诱导红细胞锚蛋白外翻到红细胞膜外侧,然而锚蛋白外翻的红细胞的比例呈PMA浓度依赖关系,而且锚蛋白外翻的红细胞的比例体现出血液捐献者的个体差异性。这意味着尽管PMA诱导PKC的激活能够促使红细胞锚蛋白的外翻,但是锚蛋白外翻的红细胞的比例与胞内游离的PKC对PMA的敏感性以及红细胞胞内PKC活性的异质性有关。为了探讨外翻的锚蛋白与整合素αvβ3的结合能否介导巨噬细胞与红细胞的黏附,本文通过对巨噬细胞黏附红细胞的检测以及封闭整合素αvβ3(封闭膜上的结合位点)和锚蛋白(封闭巨噬细胞表面的结合位点)的结合位点分析。结果表明,锚蛋白的外翻能诱发巨噬细胞的噬红细胞作用,结合位点的封闭能明显降低巨噬细胞对红细胞的黏附数量。红细胞程序性死亡往往起始于细胞内钙离子浓度的升高。提高的胞内钙离子浓度能够激活半胱氨酸肽链内切酶以及钙依赖的酶,从而降解细胞骨架及分解蛋白质,导致细胞囊泡化等,最终细胞调亡。PKC是一种钙离子依赖的酶,激活的PKC能够诱导细胞胞外钙离子的快速流入,促使其胞内钙离子水平的升高。同时激活的PKC也能诱导红细胞膜蛋白的磷酸化,从而导致红细胞膜骨架结合亲和力的减弱。因此,本文运用PKC的抑制剂Calphostin C(封闭PKC的激活位点)和Chelerythrine chloride(竞争性抑制激活的PKC的磷酸化作用位点)来分析钙离子以及锚蛋白的磷酸化与红细胞锚蛋白外翻的关系。结果表明,激活的PKC诱导细胞胞外钙离子的流入以及锚蛋白的磷酸化作用共同促使红细胞锚蛋白的外翻。此外,研究也表明仅仅是胞内钙离子水平的增加或者仅仅锚蛋白的磷酸化作用均不足以诱导红细胞锚蛋白的外翻。为了进一步探讨激活的PKC与红细胞锚蛋白外翻的关系。本文通过不连续密度梯度离心法分离出老红的红细胞层,检测其锚蛋白外翻、胞内钙离子以及锚蛋白磷酸化水平的情况。也检测了PMA诱导不同密度层红细胞的上述指标变化情况。结果表明,在老化层中有一定数目的红细胞呈现其锚蛋白的外翻。同时PMA对不同密度层红细胞的锚蛋白外翻以及胞内钙离子有不同的影响(对不同密度层红细胞锚蛋白的磷酸化水平影响却不大)。这意味着在老化的红细胞中存在着红细胞程序性死亡的信号分子—锚蛋白外翻,同时也进一步确认了诱发红细胞锚蛋白外翻的两个必不可必少的条件(胞内钙离子水平的增加以及红细胞锚蛋白的磷酸化作用)。本论文还检测了PKC诱导的锚蛋白外翻对红细胞变形性能的影响,以及PKC诱导的膜蛋白磷酸化作用导致膜骨架结合亲和力的改变与红细胞形变能力的变化关系。结果显示,锚蛋白的外翻能够引起红细胞变形性能的减弱,锚蛋白的磷酸化作用引起的红细胞膜骨架结合亲和力的改变与红细胞变形指数的变化关系不大,而蛋白4.1的磷酸化作用诱导的红细胞膜骨架结合亲和力的改变在红细胞形变能力的变化关系中有着重要的作用。因此,锚蛋白的外翻以及膜骨架结合亲和力的减少诱导的红细胞形变能力的减弱进一步促进了巨噬细胞对该红细胞的黏附。根据现有的研究成果和已发表的文献,我们推断出激活的PKC一方面诱导了细胞胞外钙离子的流入,然后胞内钙离子水平的提高激活了钙离子依赖的酶,促使了细胞的囊泡化和膜蛋白结合亲和力的减少,另一方面激活的PKC诱导的红细胞锚蛋白的磷酸化,进一步减弱膜骨架蛋白的相互作用,经过这两方面的相互作用,诱导了红细胞锚蛋白的外翻,最终导致巨噬细胞的噬红细胞作用。
【关键词】：红细胞 锚蛋白外翻 PKC 红细胞变形性能
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R331.1
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-11
• 中英文缩略词列表11-12
• 1 绪论12-24
• 1.1 研究背景12-19
• 1.1.1 红细胞程序性死亡12-14
• 1.1.2 红细胞力学性能与红细胞程序性死亡14-16
• 1.1.3 PKC与红细胞程序性死亡16-19
• 1.2 问题的提出和研究意义19-21
• 1.2.1 问题的提出19-20
• 1.2.2 研究意义20-21
• 1.3 研究内容和目的21-22
• 1.4 本课题的创新点22-24
• 2 PKC对红细胞锚蛋白外翻的影响24-38
• 2.1 引言24-27
• 2.2 材料和方法27-32
• 2.2.1 PMA诱导红细胞锚蛋白外翻的检测27-29
• 2.2.2 PKC抑制剂对PMA诱导红细胞锚蛋白外翻的检测29-31
• 2.2.3 数据统计分析31-32
• 2.3 实验结果32-35
• 2.3.1 PMA对红细胞锚蛋白外翻的影响32-33
• 2.3.2 PKC抑制剂对PMA诱导红细胞锚蛋白外翻的影响33-35
• 2.4 分析与讨论35-36
• 2.5 本章小结36-38
• 3 PKC诱导细胞胞外的钙离子流入对红细胞锚蛋白外翻的影响38-50
• 3.1 引言38-39
• 3.2 材料与方法39-44
• 3.2.1 PKC抑制剂对PMA诱导红细胞胞内钙离子水平变化的检测39-41
• 3.2.2 胞内钙离子与锚蛋白外翻红细胞的荧光双标检测41-43
• 3.2.3 数据统计分析43-44
• 3.3 实实验结果44-47
• 3.3.1 PKC抑制剂对PMA诱导红细胞胞内钙离子含量的影响44-46
• 3.3.2 胞内钙离子对红细胞锚蛋白外翻的影响46-47
• 3.4 分析与讨论47-48
• 3.5 本章小结48-50
• 4 PKC诱导膜蛋白磷酸化对红细胞锚蛋白外翻的影响50-66
• 4.1 引言50-51
• 4.2 材料与方法51-60
• 4.2.1 红细胞膜蛋白和胞间蛋白的提取51-53
• 4.2.2 锚蛋白的分离与纯化53-54
• 4.2.3 红细胞膜蛋白SDS-PAGE（5%-15%梯度胶）54-57
• 4.2.4 红细胞PKC、锚蛋白和磷酸丝氨酸的免疫印迹57-59
• 4.2.5 数据统计分析59-60
• 4.3 实验结果60-63
• 4.3.1 红细胞锚蛋白的分离、纯化和锚蛋白的磷酸化检测60-61
• 4.3.2 时间依赖的锚蛋白磷酸化检测61-62
• 4.3.3 红细胞胞内PKCα 的激活检测62-63
• 4.4 分析与讨论63-64
• 4.5 本章小结64-66
• 5 锚蛋白外翻对红细胞力学性能的影响以及巨噬细胞对锚蛋白外翻红细胞的噬红细胞作用66-78
• 5.1 引言66
• 5.2 材料与方法66-72
• 5.2.1 PMA诱导红细胞锚蛋白外翻的力学性质检测66-69
• 5.2.2 PMA诱导THP-1 分化成巨噬细胞以及其对锚蛋白外翻红细胞的识别69-71
• 5.2.3 数据统计分析71-72
• 5.3 实验结果72-74
• 5.3.1 PMA诱导的锚蛋白外翻对红细胞形变能力的影响72-73
• 5.3.2 巨噬细胞对PMA诱导的锚蛋白外翻红细胞的黏附影响73-74
• 5.4 分析与讨论74-75
• 5.5 本章小结75-78
• 6 不同天龄红细胞锚蛋白外翻的检测以及PKC对不同天龄红细胞锚蛋白外翻的影响78-92
• 6.1 引言78-79
• 6.2 材材料和方法79-85
• 6.2.1 密度剃度离心法分离不同天龄的红细胞79-80
• 6.2.2 不同天龄红细胞锚蛋白外翻和胞内钙离子的测定以及PMA对不同天龄红细胞锚蛋白外翻和胞内钙离子的影响80-83
• 6.2.3 不同天龄红细胞锚蛋白磷酸化的测定以及PMA对不同天龄红细胞锚蛋白磷酸化的影响83-84
• 6.2.4 数据统计分析84-85
• 6.3 实验结果85-88
• 6.3.1 密度剃度离心分离不同天龄的红细胞85-86
• 6.3.2 红细胞锚蛋白外翻和胞内钙离子的测定86-88
• 6.3.3 红细胞锚蛋白磷酸化的测定88
• 6.4 分析讨论88-89
• 6.5 本章小结89-92
• 7 PKC诱导膜骨架结合亲和力的变化对脊椎生物红细胞力学性能的影响92-108
• 7.1 引言92-93
• 7.2 材料和方法93-100
• 7.2.1 血液的收集93-94
• 7.2.2 人、鸡、蛙、鱼红细胞PKC的激活94-95
• 7.2.3 人、鸡、蛙、鱼红细胞变形性检测95-96
• 7.2.4 人、鸡、蛙、鱼红细胞杨氏模量检测96-99
• 7.2.5 数据统计分析99-100
• 7.3 实验结果100-105
• 7.3.1 PMA对人、鸡、蛙、鱼红细胞形变能力的影响100-101
• 7.3.2 PMA对人、鸡、蛙、鱼红细胞杨氏模量的影响101-105
• 7.4 分析讨论105-107
• 7.5 本章小结107-108
• 8 PKC诱导人、鸡、蛙、鱼红细胞蛋白 4.1 磷酸化的检测及脊椎生物红细胞蛋白 4.1 的氨基酸序列分析108-128
• 8.1 引言108-110
• 8.2 材料和方法110-120
• 8.2.1 红细胞膜骨架蛋白Spectrin以及磷酸丝氨酸蛋白的免疫印迹分析110-112
• 8.2.2 红细胞膜蛋白的提取112-113
• 8.2.3 红细胞膜蛋白SDS-PAGE（5%-15%梯度胶）113-117
• 8.2.4 红细胞膜蛋白Western Blot117-119
• 8.2.5 脊椎生物红细胞蛋白 4.1 氨基酸序列分析119
• 8.2.6 数据统计分析119-120
• 8.3 实实验结果120-125
• 8.3.1 红细胞磷酸丝氨酸蛋白以及血影蛋白的免疫荧光染色结果120-121
• 8.3.2 红细胞膜蛋白电泳121-122
• 8.3.3 红细胞膜蛋白 4.1 磷酸化检测122-123
• 8.3.4 红细胞膜蛋白 4.1 氨基酸序列分析123-125
• 8.4 分析与讨论125-126
• 8.5 本章小结126-128
• 9 结论与展望128-130
• 9.1 结论128-129
• 9.2 不足之处与后续工作展望129-130
• 致谢130-132
• 参考文献132-146
• 附录146-147
• A. 作者在攻读学位期间发表的论文目录146
• B. 参加科研项目情况146-147

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  本文关键词：PKC诱导红细胞锚蛋白外翻诱发的巨噬细胞噬红细胞作用，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：318201