我国鸡马立克氏病毒流行毒株生物学特性分析

发布时间：2017-04-20 13:21

  本文关键词：我国鸡马立克氏病毒流行毒株生物学特性分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：鸡马立克氏病(MD)是由鸡马立克氏病病毒(MDV)引起的一种高度接触性传染性疾病。发病鸡表现为精神萎靡、麻痹、共济失调、翅膀下垂、呆立,被毛凌乱等临床症状,剖检可见内脏和其他器官发生淋巴增生性肿瘤。同时,该病可引起发病鸡只的免疫抑制,造成其他病原的继发感染。MD呈世界范围内的流行,每年造成的直接经济损失在10~20亿美元。疫苗免疫是控制该病的主要手段。MD疫苗免疫属于非清除性免疫,不能够阻止野毒株的感染及排毒,导致野毒株与疫苗毒株长期共存于同一机体,促使野毒株毒力进化。过去的几十年里,MDV持续性演化,同期使用的MD疫苗保护效果不理想。近些年我国小型养禽场甚至规模化养禽场也常有MD发生,并且常伴随其它临床表现不明显的免疫抑制病病原REV,ALV和CIAV等的混合感染,给养鸡业造成巨大经济损失。因此有必要了解我国近年来鸡群中MDV感染和流行,以及其与免疫抑制病毒混合感染的情况;分析我国的MDV野毒株的致病特征和毒力变异规律;评价现有MD疫苗的免疫保护效果;分析MDV野毒株的主要致病相关基因和病毒基因组的分子特征,研究其进化规律。这些对MDV的基础研究和我国MD的防控均具有极其重要的意义。本研究于2011年~2013年间,在黑龙江、吉林、辽宁、山东、河北、江苏、内蒙古、湖南、河南和广东等10个省份的136个蛋鸡或种鸡群,从临床表现和病理变化疑似发生MD的鸡无菌采集羽髓或抗凝血,共计522份。经PCR检测,522份样品中MDV阳性样品334份,阳性率为64%;检测的136个鸡场中95个鸡群中MDV感染阳性率为69.9%;应用PCR,间接免疫荧光和/或ELISA等检测方法,对所有MDV阳性样品进行了其他免疫抑制病病毒-REV、ALV和CIAV的检测,结果表明MD阳性鸡群中REV、ALV和CIAV的阳性率分别为11.7%、21.0%和21.3%,存在着较为严重的混合感染,甚至三重和四重感染;从MDV阳性样品中分离获得45株适应细胞的病毒株,其中43株经PCR,间接免疫荧光和/或ELISA等检测证实为REV、ALV和CIAV阴性,经MDV的132碱基重复序列(132bpr)的PCR检测分析,证实获得的43株分离毒株含有2个或3个拷贝的132bp均具有MDV野毒株的特征,而另外2株经PCR、蚀斑、间接免疫荧光和电镜等方法鉴定,证实为MDV和REV混感的细胞培养物。对43株新分离的MDV野毒株及其他的MDV参考毒株的主要致肿瘤基因-meq基因序列比对和分析,结果显示中国流行毒株meq基因编码的Meq蛋白的主要分子特征为:77E,80Y,115A,139A,176R和217A;对meq的遗传进化分析表明中国商品蛋鸡或种鸡群中流行的MDV具有遗传进化多样性,meq基因存在新的变异。为研究中国MDV流行毒株的致病特征以及MDV混感REV对SPF鸡的影响,选取具有中国流行毒株meq基因典型特征、且临床发病率高和死亡率高的3株MDV分离毒(LCC,LLY和LTS株),以及1个MDV和REV混感培养物进行了致病性分析。结果表明3株MDV野毒株感染的SPF鸡各具不同的发病特征,试验结束时剖检可见绝大多数LLY和LTS接种鸡发生明显的内脏肿瘤,而LCC接种鸡无肉眼可见肿瘤,但组织病理观察可见LCC攻毒组鸡内脏组织发生肿瘤细胞浸润。这些结果提示不同野毒株诱导的肿瘤发生时间是不一致的。3株病毒均能引起SPF鸡100%发病,但是死亡率较低,LCC,LLY和LTS攻毒组鸡只死亡率别为42.9%,46.7%和23.1%。MDV和REV的混合培养物-CYM+R却能引起SPF鸡100%的肿瘤率和93.3%的死亡率;组织病理学观察可见肝脏、脾脏、肾脏和腺胃等均出现以多形态的淋巴细胞增生浸润为主的病灶,这些浸润的淋巴细胞包括小型、中型和大型淋巴细胞,取代部分原来的正常组织(腺胃);免疫组化可见腺胃腺管上皮细胞呈棕褐染色,分布于整个纤维组织。这表明MDV与REV混合感染对鸡群的危害更严重。本研究也评价了现有MD疫苗(CVI988株)对MDV流行毒株的免疫保护效果。免疫后接种MDV LCC,LLY和LTS株的鸡只发病率分别为14.3%、7.7%,和33.3%,MD疫苗(CVI988株)对它们的免疫保护指数分别为85.7,92.3和66.7。表明现有疫苗对不同MDV流行毒株的保护效果存在显著的差异。为研究MDV流行毒株在鸡体内的复制能力及疫苗对野毒株复制的干扰能力,通过荧光定量PCR法动态检测了羽髓中病毒的载量。结果表明LCC和LTS株在攻毒后14和17d病毒载量达到高峰,每百万个宿主细胞中108个拷贝数以上,LLY攻毒在攻毒后17d病毒载量达到高峰。3株病毒攻毒后21~60d维持在106个/拷贝数百万个宿主细胞以上,均显著高于免疫攻毒组的病毒载量(P≤0.05)。免疫后LTS攻毒鸡在17~21d也能达到每百万个宿主细胞中106个拷贝数以上,而免疫后LCC和LLY攻毒组病毒载量在106个拷贝以下。CVI988对LTS株在体内复制的干扰能力较低,这可以部分解释疫苗保护水平低的原因。利用细菌人工染色体技术,对MDV和REV的混合培养物CYM+R中的MDV进行分子纯化,获得一株纯净的MDV毒株,并通过二代全基因组测序分析其全病毒基因组。遗传进化树分析表明该株MDV毒株表现出与中国流行毒株具有非常接近的遗传进化关系,并未有明显的进化。表明MDV和REV的混合培养物-CYM+R的高致病能力并不是其中的MDV毒株发生显著进化造成的,更有可能是由于其于REV混合感染的结果。综上所述,本研究对我国MDV的流行情况进行了广泛的调查和分析,对MDV流行毒株的分子特征、遗传进化规律、致病特征、体内复制特点和现有MD疫苗对流行毒株的免疫保护效果进行了较为全面系统的研究和分析。同时对现地发生的MDV与其他免疫抑制病病原混感的情况进行了调查,并选择MDV与REV混感作为研究对象,分析了混感在MDV流行中的作用。本研究对MDV的基础研究和MD的防控具有重要意义。
【关键词】：鸡马立克氏病毒 流行毒株 致病特点
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-13
• 1 引言13-23
• 1.1 本研究课题的国内外研究现状及发展动态分析13-22
• 1.1.1 鸡马立克氏病和鸡马立克氏病病毒13-14
• 1.1.2 MDV的传播及感染14-15
• 1.1.3 MDV基因组及致瘤基因15-19
• 1.1.4 MDV的进化及机制19-22
• 1.2 本研究课题的目的和意义22-23
• 2 材料和方法23-33
• 2.1 实验材料23-24
• 2.1.1 病毒株、血清和单抗23
• 2.1.2 主要试剂23
• 2.1.3 主要耗材23
• 2.1.4 实验动物23-24
• 2.1.5 仪器24
• 2.2 实验方法24-33
• 2.2.1 MD的流行病学及MDV与其他免疫抑制病毒的混感调查24-26
• 2.2.2 MDV野毒株分离与鉴定26-27
• 2.2.3 MDV野毒株meq基因序列测定及分析27
• 2.2.4 MDV野毒株致病性分析27-29
• 2.2.5 MDV+REV分离物致病性分析29-30
• 2.2.6 分离物CYM+R中MDV的BAC克隆的构建30
• 2.2.7 分离物CYM+R中MDV的BAC克隆的基因组序列测定30-31
• 2.2.8 统计分析31-33
• 3 结果与分析33-55
• 3.1 MDV的流行病学及其与其他免疫抑制病毒的混感调查33-34
• 3.1.1 MD的检测33
• 3.1.2 MDV与REV、ALV和CIAV的混合感染33-34
• 3.1.3 MDV与REV、ALV和CIAV的多重感染情况34
• 3.2 MDV野毒株与MDV+REV分离物的分离与鉴定34-38
• 3.2.1 MDV野毒株的分离与鉴定34-37
• 3.2.2 MDV+REV分离物的分离与鉴定37-38
• 3.3 MDV野毒株meq基因序列测定和分析38-44
• 3.3.1 MDV分离株meq基因序列分子特征38
• 3.3.2 MDV分离株meq基因遗传进化分析38-44
• 3.4 MDV野毒株致病性分析44-48
• 3.4.1 MDV代表毒株的选择及鉴定44-45
• 3.4.2 发病率和死亡率45-46
• 3.4.3 MD肿瘤的分布46-47
• 3.4.4 组织学观察47
• 3.4.5 羽髓中MDV基因组载量的动态分析47-48
• 3.5 MDV+REV分离物的致病性分析48-51
• 3.5.1 MDV+REV分离物效价的测定48
• 3.5.2 发病率和死亡率48-49
• 3.5.3 组织学和免疫组化观察49-50
• 3.5.4 羽髓中MDV和REV基因组载量动态分析50-51
• 3.6 分离物CYM+R中MDV的纯化51-52
• 3.6.1 CYM-BAC克隆的鉴定51-52
• 3.6.2 拯救的重组病毒的鉴定52
• 3.7 CYM-BAC的基因组序列分析52-55
• 3.7.1 CYM-BAC的基因组概况52
• 3.7.2 GO数据库注释52-53
• 3.7.3 KEGG数据库注释53
• 3.7.4 CYM-BAC遗传进化分析53-55
• 4 讨论55-59
• 4.1 MDV的感染及其与其他免疫抑制病毒的混感55-56
• 4.2 分离毒株meq基因的分子特征56-57
• 4.3 MDV分离毒株致病性特征57
• 4.4 MDV混感REV的致病性分析57-59
• 5 结论59-60
• 致谢60-61
• 参考文献61-68
• 附录68-69
• 攻读博士学位期间发表的学术论文69

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