糖苷水解酶与酯水解酶稳定性和底物选择性调控的结构基础

发布时间：2017-06-24 10:06

  本文关键词：糖苷水解酶与酯水解酶稳定性和底物选择性调控的结构基础，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：以糖苷水解酶和酯水解酶为代表的水解酶类是重要的生物催化剂，在食品、饲料、洗涤、能源、医药、环境等行业均有重要应用，约占全部酶制剂市场份额的80%以上。虽然目前对这些酶的催化机制研究已经有了一定基础，但是仍缺乏对控制酶的底物选择性、热稳定性等性质的关键结构因素的系统了解，使得对其进行理性分子设计和改造的难度较大。通过X-ray晶体衍射方法解析的酶分子的三维结构，为探究酶分子的结构与功能关系提供精确的实验依据，同时为改造现有酶分子提供线索和指导。在本论文中，我们基于前期酶学研究基础，以结构生物学为主要依托，针对几类代表性糖苷水解酶和酯水解酶开展了以下研究： （1）嗜热木聚糖酶CbXyn10B的系统酶学表征及其晶体结构解析 木聚糖酶可高效水解-1,4-糖苷键，在木聚糖的降解和利用中有着重要的应用潜力。我们克隆、表达和纯化了Caldicellulosiruptor bescii中GH10家族的木聚糖酶CbXyn10B，性质表征发现该酶具有较高的木聚糖水解活力（~450U/mg）、良好的热稳定性（60°C下的半衰期t1/2为7.7h）和pH稳定性，并且对木聚糖显示较高的底物专一性。为了进一步探究CbXyn10B独特功能的结构基础，我们通过X-ray晶体衍射方法解析了CbXyn10B及其酶/底物复合物的三维结构（分辨率为1.70-2.05），并与相关中温酶结构进行比较。结果表明，CbXyn10B呈现典型的(α/β)8-barrel结构，其分子表面loop8上的Lys306和Arg314的侧链，分别通过三个高度有序的水分子，在loop8的主链（Phe309和Pro310的羰基）和loop7的主链（Phe255、Asp257和Arg259的羰基）之间形成了相互交错的氢键网络，这可能对于维持酶的稳定性起到了关键作用；此外，在N-、C-末端之间存在着一系列紧密的相互作用：一方面由Tyr17、Phe20、Phe21和Phe337四个芳香族氨基酸组成了疏水堆叠簇，另一方面通过Phe20-Arg288和Lys16-Phe337-Arg285形成了Cation-π相互作用，这可能也对酶分子的稳定起到了贡献。我们通过丙氨酸扫描突变探测了这些推测的相互作用对酶稳定性的影响，发现突变体K306A、R314A、F20A、F337A和F20A/F337A的热稳定性均明显降低，证明了以上区域对酶分子整体稳定性的关键作用。 （2）嗜热木聚糖酶CbX的酶学性质表征及其结构域模块功能的研究 GH11家族的木聚糖酶是目前研究较为充分的糖苷水解酶家族之一，该家族中许多成员均由催化结构域（CD）和糖苷结合模块结构域（CBM）构成。为了深入理解酶结构模块间的相互作用，我们克隆、表达和纯化了嗜热细菌C. bescii中GH11家族木聚糖酶CbXyn11A（以下简称为CbX），并构建了其不同结构模块删除的突变体，并对其进行了系统的生化性质研究。结果显示，，CbX具有较高的催化活力（~2500U/mg）和良好的热稳定性（70°C下的t1/2为9.6h）；删除其CBM模块后获得的突变体CbX-CDL和CbX-CD稳定性比野生型提高了33倍和26倍，证明该模块对于酶的稳定性起关键调节作用；CbX-CD的C-末端比多数GH11家庭成员多出的5个氨基酸，将其删除使酶的稳定性大大减低（60倍）。结构分析显示，这5个氨基酸与邻近反平行的β-片层上的氨基酸残基形成多个氢键，从而稳定了CbX-CD的结构。这些关键信息有助于理解GH11家族木聚糖酶的稳定性机制，为进一步进行分子改造奠定了基础。 （3）嗜热纤维二糖水解酶CbCBH48A的晶体结构解析 GH48家族的纤维二糖水解酶能够协同多种纤维素酶降解木质纤维素，是生物质资源利用体系的关键酶之一。但由于目前PDB数据库中第48家族糖苷水解酶的结构仅有5个，使得对其结构和催化机制的了解极为有限。本实验室前期研究发现，C. bescii中的纤维二糖水解酶CbCBH48A具有良好的热稳定性，可以通过与C. bescii内切纤维素酶CbCel9A和F. nodosum Rt17-B1内切纤维素酶FnCel5A等协同作用，加速纤维素的水解。在此基础上，我们解析了CbCBH48A及其酶与底物复合物的晶体结构（分辨率为1.70-2.00）。CbCBH48A整体结构为(α/α)6-barrel，内部螺旋N-末端的长loop形成一个分子内部隧道和一个覆盖在桶顶端的开放的裂隙区域，催化残基位于表面裂隙和隧道区域交界处的凹槽内。根据酶-底物复合物结构推测，酶催化活性中心的Glu60作为质子供体，Asp231作为质子受体；底物分子纤维二糖和纤维四糖位于裂隙区域（产物释放端），其非还原端朝向活性中心，暗示CbCBH48A是从纤维素的还原端向非还原端渐进性地切割糖链。我们的工作丰富了该家族的结构信息，有助于其结构与功能关系的分析。 （4）嗜热内酯酶GkaP底物特异性调控的结构基础 磷酸三酯酶（Phosphotriesterase, PTE）能够高效地水解多种有机磷化合物，在有机磷污染物的脱毒、动物有机磷中毒的预防治疗以及有机磷化合物检测的酶传感器等方面有重要的应用前景。嗜热细菌G. kaustophilus HTA426类磷酸三酯酶的内酯酶（Phosphotriesterase-like lactonase, PLL）GkaP不仅具有良好的热稳定性（80°C下的t1/2为8h），而且能够非专一性的水解多种有机磷化合物。为探讨该酶的底物选择性机制，提高其对有机磷毒剂的水解活性，本实验室前期对其家族进行了序列和结构分析。发现位于GkaP活性中心的99位点可能在酶的底物特异性方面起关键作用。定点饱和突变获得的突变体Y99L对对氧磷（paraoxon）的催化效率提高11倍，而对δ-癸内酯（decalactone）的催化效率则降低15倍，底物选择性产生了165倍的变化。为阐明这些突变体的构效关系，我们解析了GkaP及其Y99L的晶体结构，分辨率分别为1.60和1.75。结构分析发现，活性中心99位点可以调节活性位点表面loop7的闭合和开放构象：在野生型GkaP中，99位点氨基酸为Tyr，loop7为闭合构象；而在突变体Y99L中，loop7则偏离活性中心6.6-8.6，为开放构象，扩大了底物结合口袋，有利于对氧磷底物的结合和产物的释放，从而加快反应速率。 （5）脂肪酶CalB热动力学稳定性调控的结构基础 南极假丝酵母的脂肪酶B（Candida antarctica lipase B, CalB）具有严格的立体选择性，是目前在精细化工方面应用的最为广泛的脂肪酶之一。然而，CalB较低的热稳定性成为限制其广泛应用的关键瓶颈之一。本实验室前期通过酶活性中心稳定化的策略，对CalB活性中心区域柔性较大的氨基酸进行定点饱和突变，获得了D223G，L278M和D223G/L278M三个突变体，其在48°C的半衰期分别较野生型提高了3倍、6倍和13倍。为了研究以上突变体热稳定性提高的结构基础，我们解析了CalB和突变体D223G，L278M，D223G/L278M的晶体结构（1.50-1.60），发现在突变体D223G/L278M中，位于活性中心的α10螺旋上形成了一个连续的氢键网络，增强了α10螺旋刚性，提升了活性中心底物结合部位的刚性，从而提升酶的动力学稳定性。为进行酶分子的热动力学稳定性改造提供了新的途径。
【关键词】：木聚糖酶 纤维素酶 磷酸三酯酶 脂肪酶 X-ray晶体结构 结构-功能关系 热稳定性 酶分子改造
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q55
【目录】：

• 摘要4-8
• Abstract8-15
• 第一章 前言15-41
• 1.1 糖苷水解酶简介15-29
• 1.1.1 木聚糖和木聚糖酶16-24
• 1.1.2 纤维素和纤维素酶24-29
• 1.2 酯水解酶简介29-35
• 1.2.1 类磷酸三酯酶的内酯酶29-33
• 1.2.2 脂肪酶33-35
• 1.3 主要研究方法介绍35-38
• 1.3.1 X-ray 衍射晶体学35-36
• 1.3.2 同源建模36
• 1.3.3 分子动力学模拟36-37
• 1.3.4 分子对接37
• 1.3.5 差示热量扫描37
• 1.3.6 等温量热滴定37-38
• 1.4 立题依据38-41
• 第二章 嗜热木聚糖酶 CbXyn10B 的克隆、表达、酶学性质表征及晶体结构解析41-87
• 2.1 引言41
• 2.2 材料和试剂41-45
• 2.2.1 菌株和质粒41-42
• 2.2.2 主要试剂42
• 2.2.3 主要软件42
• 2.2.4 主要仪器42-43
• 2.2.5 溶液配制43-45
• 2.2.6 常用培养基45
• 2.3 实验方法45-53
• 2.3.1 CbXyn10B 的序列分析45
• 2.3.2 CbXyn10B 及其突变体的构建45-47
• 2.3.3 CbXyn10B 的表达和纯化47-48
• 2.3.4 活力测定48-49
• 2.3.5 定点饱和突变库的筛选49-50
• 2.3.6 CbXyn10B 的基本酶学性质表征50-51
• 2.3.7 CbXyn10B 及其突变体的热力学稳定性分析51
• 2.3.8 CbXyn10B 晶体的制备与储存51-52
• 2.3.9 晶体衍射数据的收集和三维结构的解析52-53
• 2.3.10 分子动力学模拟53
• 2.4 结果与分析53-85
• 2.4.1 CbXyn10B 的序列分析53-55
• 2.4.2 CbXyn10B 的表达与纯化55-56
• 2.4.3 CbXyn10B 酶学性质表征56-65
• 2.4.4 CbXyn10B 及其酶-底物复合物晶体结构的分析65-72
• 2.4.5 CbXyn10B 结构稳定的因素72-82
• 2.4.6 CbXyn10B 活性中心+2 亚位点的功能研究82-85
• 2.5 小结85-87
• 第三章 嗜热木聚糖酶 CbX 的克隆、表达、酶学性质表征及其结构域模块功能的研究87-103
• 3.1 引言87-88
• 3.2 材料和试剂88
• 3.2.1 菌株和质粒88
• 3.2.2 主要试剂88
• 3.2.3 主要仪器88
• 3.2.4 溶液配制88
• 3.2.5 常用培养基88
• 3.3 实验方法88-93
• 3.3.1 CbX 的结构序列分析88-89
• 3.3.2 CbX 及其截短突变体重组质粒的构建89-91
• 3.3.3 CbX 及其截短突变体的表达与纯化91
• 3.3.4 活力测定91-92
• 3.3.5 CbX 及其截短突变体的基本酶学性质表征92
• 3.3.6 CbX 及其截短突变体的动力学稳定性测定92
• 3.3.7 CbX 及其截短突变体的热力学稳定性测定92-93
• 3.3.8 CbX 及其截短突变体的表观动力学参数测定93
• 3.3.9 等温量热滴定93
• 3.4 结果与分析93-102
• 3.4.1 CbX 的结构序列分析93-96
• 3.4.2 CbX 及其截短突变体的表达与纯化96
• 3.4.3 CbX 及其截短突变体的基本酶学性质表征96-98
• 3.4.4 CbX 及其截短突变体的动力学稳定性98-99
• 3.4.5 CbX 及其截短突变体的热力学稳定性99-100
• 3.4.6 CbX 及其截短突变体表观动力学常数比较100-101
• 3.4.7 CbX-CBM 的功能101-102
• 3.5 小结102-103
• 第四章 嗜热纤维二糖水解酶 CbCBH48A 的晶体结构解析103-113
• 4.1 引言103
• 4.2 CbCBH48A 的表达与纯化103-104
• 4.3 CbCBH48A 晶体的制备和衍射数据的收集与处理104-105
• 4.4 CbCBH48A 结构模型的搭建和质量评估105-106
• 4.5 CbCBH48A 及其酶-底物复合物晶体结构的分析106-111
• 4.5.1 CbCBH48A 的整体结构106-107
• 4.5.2 CbCBH48A 复合物的结构107-108
• 4.5.3 CbCBH48A 与同家族成员的结构比较108-111
• 4.6 小结111-113
• 第五章 嗜热内酯酶 GkaP 底物特异性调控的结构基础113-121
• 5.1 引言113
• 5.2 GkaP 和突变体 Y99L 的底物特异性分析113-114
• 5.3 GkaP 和突变体 Y99L 的表达与纯化114-115
• 5.4 GkaP 和突变体 Y99L 晶体的制备和衍射数据的收集与处理115-116
• 5.5 GkaP 和突变体 Y99L 结构模型的的搭建和质量评估116-117
• 5.6 99 位点氨基酸影响 GkaP 底物特异性的结构基础117-119
• 5.7 小结119-121
• 第六章 脂肪酶 CalB 热动力学稳定性调控的结构基础121-129
• 6.1 引言121
• 6.2 CalB 和突变体 D223G/L278M 的热稳定性研究121-122
• 6.3 CalB 及其突变体的表达与纯化122-123
• 6.4 CalB 及其突变体晶体的制备和衍射数据的收集与处理123
• 6.5 CalB 及其突变体结构模型的的搭建和质量评估123-125
• 6.6 CalB 活性中心的刚性与酶的动力学稳定性125-127
• 6.7 小结127-129
• 附录Ⅰ129-130
• 附录Ⅱ130-131
• 附录Ⅲ131-132
• 附录Ⅳ132-133
• 创新点133-135
• 展望135-137
• 作者简介137
• 攻读博士期间取得的科研成果137-138
• 参与的科研课题138-139
• 致谢139-141
• 参考文献141-152

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张宁宁;林白雪;何柳;余能富;刘斌;谢联辉;;降解半纤维素嗜热菌的筛选及其酶学性质[J];福建农林大学学报(自然科学版);2010年05期

2 熊亚红;苏健鸿;刘小平;;修饰脂肪酶催化水解反应的动力学和热力学研究[J];分子催化;2010年05期

3 章素平;柳志强;郑裕国;;南极假丝酵母脂肪酶B的修饰与改造[J];基因组学与应用生物学;2011年02期

4 舒正玉;王爱玲;杨江科;闫云君;;提高微生物脂肪酶产量、活性和稳定性的方法研究[J];工业微生物;2007年03期

5 柯飞;王海阔;何成飞;王峗;赵安芳;;产脂肪酶菌株的筛选、鉴定及其发酵条件优化[J];广州化工;2014年01期

6 付显锋;郑建永;应向贤;鄢洪德;汪钊;;紫外分光光度法表征Lipozyme TL IM脂肪酶转酯化活性(英文)[J];催化学报;2014年04期

7 黎小军;谢莲萍;刘建宏;朱婷婷;刘蓉;;产脂肪酶菌株的筛选、鉴定与产酶条件优化[J];江西师范大学学报(自然科学版);2014年01期

8 李振东;陈秀蓉;杨成德;李鹏;;线叶嵩草内生产纤维素酶细菌分离及初步鉴定[J];草业科学;2014年01期

9 李友杰;张振华;谢彬;于世峰;李金媛;杨鹏;李洪珠;巩江;倪士峰;;甘蔗养生价值探析[J];安徽农业科学;2014年05期

10 陈燕;裴建新;郭媛;林丽华;黄日波;庞浩;;阴沟肠杆菌一个内切纤维素酶Cel8A的克隆和功能证实[J];广西科学;2014年01期

中国重要会议论文全文数据库 前2条

1 Ryan Bell;John Noakes;Tim Short;;Community structure of archaea in the water column above gas hydrates in the Gulf of Mexico[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年

2 林信一;杝家浩;;pH\ o盏氐乃�生植物哢理和能源回收影

本文编号：477812