Ksper通道和Catsper通道在调节胞内钙离子浓度以及维持精子细胞膜电位中的功能研究

发布时间：2017-07-08 16:02

  本文关键词：Ksper通道和Catsper通道在调节胞内钙离子浓度以及维持精子细胞膜电位中的功能研究

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【摘要】：小鼠的精子细胞上表达了一种酸性敏感的钾通道Ksper,有研究表明在精子细胞通过雌性生殖道准备受精的过程中,Ksper可以产生超极化膜电位以增加钙离子从碱性激活的钙通道Catsper的内流,该过程即所谓的精子细胞获能过程。但是,由于这两种通道动力学的复杂性的限制,膜电位以及胞内pHi调控Ksper和Catsper通道的机制的解析依然任重道远。用共聚焦钙成像的方法,通过加入Ksper通道的阻断剂奎尼丁(Quinidine,QD).氯非铵(Clofilium)和氯化铵(NH4C1),我们发现了野生型精子细胞(WT)和Ksper敲除(KO)的精子细胞(Sklo3-/-)胞内钙浓度的不同变化,说明Ksper通道(由S1o3基因编码)在精子获能的过程中,通过控制精子细胞膜电位来增加胞内钙浓度[Ca2+]i和酸性[pH]i,在受精的过程中起到了关键的作用。随后,我们基于从小鼠精子细胞中测得的原生Ksper和Catsper电流建立了精子的细胞模型。利用电流钳测得的膜电位实验数据,通过精子细胞模型中建立的膜电位与胞内pHi间的关系方程,我们可以反算出该膜电位过程中的相应的胞内pHi变化。显然,未来在精子细胞上探索通道的门控特性和生理作用方面还需要更深入的研究。我们的研究数据同其它课题组的研究结果一致,都说明了胞内钙浓度[Ca2+]i核心的、基本的作用,并且精子细胞与雌性生殖道环境的相互作用对维持精子胞内“正常”的钙信号和精子的受精能力至关重要。我们的实验结果表明：低浓度的奎尼丁(0.1和1μM)引起的胞内钙信号的降低可以通过对药物的洗脱得到完全的恢复,而高浓度的奎尼丁(10、100和1000μM)引起的胞内钙信号降低只能部分恢复。并且我们发现,氯非铵(50、100和500μM)可以通过阻断Ksper通道来抑制钙离子的内流。与低浓度的奎尼丁引起的可逆钙浓度降低可以恢复到正常水平相比,氯非铵的阻断是不可逆的,并且奎尼丁和氯非铵的阻断效果均依赖于钾离子的流动和细胞膜电位水平。我们同时发现,10μM奎尼丁+10mM氯化铵或者50μM氯非铵+10mM氯化铵在野生型精子细胞中引起的钙浓度降低是可以恢复的。三种药物对野生型精子细胞的作用要比Slo3-/-敲除的精子细胞明显。Slo3-/-敲除的小鼠精子细胞实验进一步证明了我们观察到的各种钙信号的变化都源于药物对CatSper或KSper等通道的作用而产生。我们用Slo3-/-敲除的小鼠精子细胞在相同条件下重复检验发现,由于缺失Slo3通道而这种通道被氯非铵的阻断是不可恢复的,此时氯非铵引起的胞内钙信号的降低是可逆的。这说明奎尼丁和氯非铵在Slo3-/-敲除的小鼠精子细胞中引起的钙信号的降低不是由于阻断了Slo3通道,而可能是直接阻断Catsper或细胞上的其它通道。此外,同野生型细胞一样,10mM氯化铵对Slo3-/敲除的小鼠精子细胞也可以引起内钙的上升,这暗示Catsper通道可能也是-个酸性敏感的通道。 精子细胞膜电位pH依赖性的模型模拟结果是通过对电流钳记录的野生型及Slo3-/-敲除的精子细胞在一系列pH条件下的膜电位的模拟来实现的。我们发现随着pH的上升,野生型精子细胞的膜电位逐渐向超极化方向移动,而在Slo3-/-敲除的精子细胞中,膜电位则向着相反的去极化方向移动。我们建立的野生型及Slo3-/-敲除的精子细胞模型不仅可以说明Ksper通道在精子细胞获能中的作用机制,并且建立了pH和膜电位Vm的关系,这样我们可以利用电流钳的实验数据快速的反算出野生型及Slo3-/-敲除的精子胞内的相应的pH信号,这对精子细胞的后续研究具有重要意义。 近来,通过靶向于精子发育、成熟和功能的具体过程,科研人员们正在研究使用奎尼丁用做钙通道阻断剂来开发出男性避孕的新方法。奎尼丁的短暂处理对小鼠精子和睾丸组织有显著抗精和抗生育的避孕效果,我们研究QD对精子参数的毒性作用结果表明,QD对雄性小鼠的生精小管和精子形成会产生不利影响并可能导致雄性生精能力及生育能力的功能紊乱。这些结果对新型避孕方法的发现提供了较好的数据支撑。
【关键词】：精子的Ca~(2+)信号 精子的离子通道 ksper卡斯帕 catsper 男性的生育能力
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q954.434
【目录】：

• ABSTRACT4-6
• 摘要6-8
• List of Contents8-10
• List of Figures10-12
• List of Tables12-13
• 1. Introduction13-28
• 1.1 The Principle Reasons for Studying the Spermatozoa Ion Channels13-14
• 1.2 Sperm Physiology14-15
• 1.3 Maturation of Epididymal sperm15
• 1.4 Sperm Capacitation15-17
• 1.5 Hyperactivation17-19
• 1.6 The acrosome reaction19-20
• 1.7 Calcium signaling in sperm20-21
• 1.8 Sperm Cells Ca~(2+) Channels21-24
• 1.9 Classification of Ion Channels24
• 1.10 CatSper form a Ca~(2+) -selective channel24-28
• 1.10.1 Biophysical properties of Catsper channel25-26
• 1.10.2 Biophysical characterization of CatSper currents(ICatSper)26-28
• 2. Potassium channels Ksper and its role in male fertility28-42
• 2.1 Potassium Channel of Sperm(KSper/Slo3)28-29
• 2.2 Biophysical properties of Slo329-31
• 2.3 Other Calcium(Cation)Channels31-32
• 2.4 Ca~(2+)-Activated Cl~- Channels(CaCCs)32
• 2.5 Na~+/H~+ exchangers32-33
• 2.6 CatSper and Slo3 as a pH_i dependent ion channels33-36
• 2.7 Pharmacological Compounds were used for characterization of Ca~(2+) channels in sperms36-42
• 3. Materials and Methods42-50
• 3.1 Protocol of Ca~(2+) Imaging42-45
• 3.2 Pharmacology45-50
• 4. Functional study of ksper and catsper channels in regulatingintracellular Ca~(2+) concentration and maintaining membrane potential ofsperm cells50-82
• 4.1 Introduction50-51
• 4.2 Materials and Methods51-55
• 4.3 Statistical Analysis55-56
• 4.4 Results56-76
• 4.5 Discussion76-80
• 4.6 Conclusion80-82
• Acknowledgement82-83
• References83-101
• Publication during my doctor degree101-102
• Abbreviations102-103

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本文编号：535235