壳聚糖酶OU01底物结合与催化机理研究

发布时间：2017-07-27 12:03

  本文关键词：壳聚糖酶OU01底物结合与催化机理研究

  更多相关文章： 壳聚糖酶 复合物结构 X-射线晶体学 突变 水解机理

【摘要】：壳寡糖是具有多种生物学功能的生物活性物质,在医药卫生、食品、农业等方面都具有广泛的研究及应用。在壳寡糖的制备方法中,以壳聚糖酶为基础的酶降解法具有专一性强,酶切效率高,反应条件温和,环保等优点,正受到越来越多的关注。迄今为止,已经从细菌、植物组织里发现了多种壳聚糖酶,对壳聚糖酶的基本性质、水解方式等都开展了研究。目前,已有三种壳聚糖酶单体的结构得到解析,为壳聚糖酶的研究提供了结构基础,但壳聚糖酶对底物的降解机制仍然不清楚。为此,本论文通过培养酶与底物复合物晶体,解析复合物的三维结构,从分子水平上对壳聚糖酶与底物的结合机理进行深入研究。本研究选取了酶活性较高的chitosanase OU01为研究对象,主要进行了以下几个方面的工作：1、从菌株Microbacterium sp的基因组中克隆了不含信号肽的chitosanase OU01基因。将基因与pGEX-6p-1相连,转化到E. coli BL21(DE3)中,构建了chitosanaseOU01的原核表达系统。通过IPTG诱导成功表达了重组蛋白。通过亲和层析、柱上酶切和凝胶过滤层析对重组蛋白进行了分离纯化,最终获得高纯度的chitosanase OU01,电泳结果显示其分子量在30 kDa左右。2、利用TLC,质谱,NMR技术对chitosanase OU01的动力学参数、酶解产物、水解动力学进行了研究。基本动力学参数如下：Km为4.197mg/ml,最大反应速率Vmax为0.049 μmol/min,催化常数Kcat为12,297 min-1,比活力为476.6U/mg·protein;对脱乙酰度大于90%(DDA90%)壳聚糖进行充分水解后得到的产物主要为壳二糖和壳三糖：水解脱乙酰度大于99%(DDA99%)壳聚糖的整体水解过程表现出先快后慢的非均一性动力学过程。3、参考序列比对,利用定点突变技术将两个氨基酸(Glu25与Asp43)分别突变成Ala,获得无催化活性的突变体,用于与壳六糖底物共混,进行复合物结晶。经过晶体生长条件的筛选与优化,获得了可用于X-射线衍射数据收集的复合物晶体。在此基础上,对复合物晶体结构进行了解析,首次获得了壳聚糖酶与底物的复合物晶体结构(PDB 1D:4OLT:4QWP).4、复合物结构的解析,进一步从结构角度确定了chitosanase OU01采用的是"inverting"催化机理,并首次阐明了催化关键氨基酸在催化反应中的作用。5、通过复合物结构,首次揭示了chitosanase OU01结合口袋内部与每一个糖单元的相互作用。通过定点突变,进一步验证了chitosanase OU01结合口袋内部对底物结合起重要作用的氨基酸。6、综合复合物结构、产物结构和分子对接分析,确定了-2位是chitosanase OU01中的底物特异性识别位点,该位点只能结合氨基葡萄糖,属于D-X-X((-2)-(-1)-(+1))型底物特异性水解酶,该研究对chitosanase水解底物的特异性进行了重新定义。7、通过表面电荷分析与突变体活性验证,寻找到了结合口袋之外对长链壳聚糖底物的结合起重要作用的氨基酸Asp40。8、依据关键氨基酸残基对不同底物活性的影响及空间结构,对参与底物结合的关键氨基酸进行了分类,在此基础上,阐明了两类底物(寡糖底物和长链底物)与酶的复合物形成机理,并首次提出了长链底物与壳聚糖酶的“三步”结合原理。9、通过复合物与文献报道的壳聚糖酶单体的结构比较,明确了“非连续”型壳聚糖酶在结构上的两个重要特征,一是结合口袋在水解过程中按照“开放-关闭-开放”的形式进行构象变化;二是参与底物结合的位点多为极性氨基酸,因此,酶与底物之间形成的相互作用主要是专一的氢键和静电作用。本研究主要通过酶与底物的复合物晶体结构的解析,结合定点突变等生化技术,对chitosanase OU01的催化机理、酶切位点特异性、酶与底物复合物形成机理、“非连续”型壳聚糖酶结构特点等进行了研究,为壳聚糖酶的开发及应用提供了理论基础。
【关键词】：壳聚糖酶 复合物结构 X-射线晶体学 突变 水解机理
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q55
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-16
• 第一章 文献综述16-36
• 1 壳寡糖概述16-19
• 1.1 壳寡糖的来源及功能16-18
• 1.2 壳寡糖的制备18-19
• 2 壳聚糖酶概述19-23
• 2.1 壳聚糖酶的来源19-20
• 2.2 壳聚糖酶的分类20-21
• 2.3 壳聚糖酶基因的获得及体外异源表达系统构建21-22
• 2.4 壳聚糖酶的性质22
• 2.5 壳聚糖巧的生物学功能及应用22-23
• 3 蛋白质X-射线晶体学概述23-29
• 3.1 蛋白质结构的测定方法23-24
• 3.2 蛋白质X-射线晶体学概述24-29
• 4 壳聚糖酶的三维空间结构简介29-30
• 5 GH46壳聚糖酶研究现状30-35
• 5.1 壳聚糖酶的催化机理31-32
• 5.2 壳聚糖酶水解过程及产物分析32-33
• 5.3 壳聚糖酶中与催化相关的氨基酸功能研究33-35
• 6 选题背景和研究意义35-36
• 第二章 Chitosanase OU01在大肠杆菌中的重组表达及酶的分离纯化36-52
• 第一节 Chitosanse OU01基因克隆及表达载体的构建36-46
• 1 材料与试剂36-37
• 1.1 菌株与质粒36-37
• 1.2 试剂37
• 2 实验方法37-42
• 2.1 细菌基因组提取37-38
• 2.2 引物设计38-39
• 2.3 PCR扩增及产物回收39-40
• 2.4 目的片段及表达载体的双酶切处理40
• 2.5 目的片段与表达载体连接40-41
• 2.6 转化E.coli DH5α感受态细胞41
• 2.7 表达菌株的构建41-42
• 3 实验结果42-45
• 3.1 Chitosanse OU01基因的克隆42-43
• 3.2 目的基因与表达载体双酶切结果43-44
• 3.3 重组表达菌株的构建44-45
• 4 讨论45
• 5 小结45-46
• 第二节 Chitosanse OU01在大肠杆菌中的表达及重组蛋白的分离纯化46-52
• 1 材料试剂与主要仪器设备46
• 2 实验方法46-48
• 2.1 重组蛋白的诱导表达46-47
• 2.2 菌体破碎47
• 2.3 亲和层析及柱上酶切47
• 2.4 凝胶过滤层析47-48
• 3 实验结果48-50
• 3.1 重组蛋白的表达48
• 3.2 亲和层析及柱上酶切对chitosanase OU01的纯化48
• 3.3 凝胶过滤层析纯化结果48-50
• 4 讨论50-51
• 5 小结51-52
• 第三章 Chitosanase OU01动力学参数测定、酶解产物及酶动力学分析52-62
• 1 实验试剂与主要仪器52-53
• 2 实验方法53-55
• 2.1 DNS标准曲线的制作53
• 2.2 蛋白质浓度的测定53-54
• 2.3 壳聚糖酶活力的测定54
• 2.4 Chitosanase OU01动力学常数的测定54
• 2.5 Chitosanase OU01水解产物分析54-55
• 2.6 Chitosanase OU01水解动力学研究55
• 3 实验结果55-59
• 3.1 Chitosanase OU01的米氏常数55-56
• 3.2 水解产物的质谱分析56-57
• 3.3 水解产物的TLC分析结果57-58
• 3.4 不同时间点水解样品的NMR分析58-59
• 3.5 水解曲线59
• 4 讨论59-61
• 5 小结61-62
• 第四章 Chitosanase OU01-(GlcN)_6复合物晶体的培养与结构解析62-78
• 1 实验试剂与主要仪器62
• 2 实验方法62-66
• 2.1 催化关键氨基酸的确定62-63
• 2.2 关键氨基酸的定点突变63-64
• 2.3 突变体蛋白的表达与分离纯化64
• 2.4 突变体E25A与D43A活性测定64
• 2.5 酶与底物复合物晶体的生长与筛选64-65
• 2.6 晶体数据的收集65-66
• 2.7 晶体结构解析66
• 3 实验结果66-75
• 3.1 催化关键氨基酸的确定66-67
• 3.2 氨基酸定点突变67
• 3.3 突变体活性67
• 3.4 酶与底物复合物的形成67-68
• 3.5 晶体生长条件筛选68
• 3.6 复合物晶体衍射数据收集及结构解析68-71
• 3.7 复合物晶体的整体结构描述71-73
• 3.8 六糖底物的电子密度图73-74
• 3.9 Chitosanase OU01空间结构比较74-75
• 4 讨论75-77
• 5 小结77-78
• 第五章 基于复合物结构的底物结合特异性及催化机理研究78-103
• 第一节 Chitosanase OU01结合口袋内部酶与底物的相互作用分析78-87
• 1 实验试剂与主要仪器78
• 2 实验方法78-81
• 2.1 结合口袋内酶与底物相互作用分析78
• 2.2 突变体的制备78-79
• 2.3 酶活性测定79
• 2.4 酶的热稳定性实验79-81
• 3 实验结果81-85
• 3.1 结合口袋内部酶与底物形成的相互作用81-83
• 3.2 突变体活性测定83
• 3.3 各个突变体蛋白质构象的变化研究(DSF)83-85
• 4 讨论85-86
• 5 小结86-87
• 第二节 Chitosanase OU01的催化机理研究87-92
• 1 实验方法87
• 2 实验结果87-89
• 2.1 E25A复合物结构中催化关键作用的分析87-88
• 2.2 D43A复合物结构中催化关键作用的分析88-89
• 3 讨论89-91
• 4 小结91-92
• 第三节 Chitosanase OU01酶切位点底物结合特异性分析92-103
• 1 实验试剂92
• 2 实验方法92-94
• 2.1 水解DDA=50%壳聚糖92
• 2.2 水解产物的质谱分析92-93
• 2.3 水解产物的甲基化处理93
• 2.4 二级质谱分析93
• 2.5 分子对接93-94
• 3 实验结果94-98
• 3.1 水解DDA=50%壳聚糖94
• 3.2 水解产物质谱分析94-95
• 3.3 水解产物的甲基化及质谱分析95
• 3.4 水解产物的结构分析95-97
• 3.5 分子对接97-98
• 4 讨论98-102
• 5 小结102-103
• 第六章 壳聚糖酶与底物复合物的形成机理103-119
• 1 实验方法103-105
• 1.1 结合口袋外部底物结合位点预测103
• 1.2 预测氨基酸功能的验证103-104
• 1.3 突变体D40A的酶热稳定分析104
• 1.4 小分子底物的制备及组分鉴定104
• 1.5 突变体对小分子底物的活性测定104-105
• 1.6 由底物结合引起的酶构象变化分析105
• 2 实验结果105-112
• 2.1 复合物结构表面电荷分析及底物结合位点预测105-106
• 2.2 预测氨基酸突变体的相对酶活性106-107
• 2.3 突变体D40A热稳定性分析107
• 2.4 小分子底物的制备107-108
• 2.5 突变体对小分子底物的相对活性108-109
• 2.6 底物结合引起的酶构象变化分析109-112
• 3 讨论112-118
• 4 小结118-119
• 全文总结119-121
• 论文创新点121
• 论文不足及下一步研究计划121-122
• 参考文献122-131
• 致谢131-132
• 个人简历132-133
• 发表的学术论文133

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