香鳞毛蕨中黄酮代谢途径关键酶基因的克隆与功能验证

发布时间：2017-08-24 17:29

  本文关键词：香鳞毛蕨中黄酮代谢途径关键酶基因的克隆与功能验证

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【摘要】：香鳞毛蕨[Dryopteris fragrans(L)Schott]是一种多年生的天然药用植物。在我国黑龙江省五大连池地区分布最为广泛。香鳞毛蕨的生境具有特殊性,比较倾向于生长在火山喷发后的熔岩地区,对一些特殊环境都有一定的适应性,但是香鳞毛蕨自然生长的种群一旦遭到破坏,恢复起来非常缓慢。迄今为止,一些研究人员主要在形态解剖学观察、化学成分的提取分离及药理活性等方面对香鳞毛蕨进行研究,关于香鳞毛蕨中次生代谢途径相关酶基因的研究进行的较少。随着对香鳞毛蕨的不断开发利用,野生香鳞毛蕨面临着濒危的现状,因此对人工种植高含量有效物质香鳞毛蕨植株的研究迫在眉睫。本论文主要是以香鳞毛蕨组织培养植株为材料,根据电子克隆获得的序列及其他已知序列的保守区设计特异引物,分别克隆了香鳞毛蕨中的CHI、F3H、PAL及C4H基因的保守片段,同时初步筛选出了香鳞毛蕨中PAL基因家族的三个成员。利用Real-Time PCR方法对Df PAL基因家族Df PAL1、Df PAL2、Df P-AL3及Df C4H四个基因在香鳞毛蕨中的不同组织及不同处理条件下的基因表达情况进行检测,初步确定对Df PAL3和Df C4H进行深入地研究。本文采用RACE技术克隆了Df PAL3和Df C4H的c DNA全长,利用生物信息学分析,对两个序列的结构、蛋白质结构和理化性质进行了研究,通过构建系统发育树确定香鳞毛蕨的分类系统位置。同时成功构建了植物表达载体p BI121-Df C4H和p BI121-Df CHS,通过侵花法对拟南芥野生型植株进行遗传转化,通过PCR方法检测了转基因植株,收取T1代种子。同时对转基因植株的第一代谢产物和终产物进行测定,来初步验证Df C4H和Df CHS基因在黄酮类化合物生物合成途径中的功能,从而为提高代谢产物进行基因调控提供了理论依据,为进一步研究Df C4H和Df CHS基因在香鳞毛蕨中的功能奠定了基础。本研究中得到的主要实验结果如下:1.本论文通过对香鳞毛蕨转录组数据进行分析,筛选出黄酮代谢途径关键酶基因四个,分别为Df CH-I、Df F3H、Df PAL及Df C4H,同时又对这四个基因进行了电子克隆。2.从香鳞毛蕨中克隆了Df CHI基因保守序列,大小为452 bp,与其他已知序列的一致性为55%-57%,Gen Bank序列号为KP658975。3.从香鳞毛蕨中克隆了Df F3H基因保守序列,大小为693 bp,与其他已知序列的一致性为63%-62%,Gen Bank序列号为KP658976。4.从香鳞毛蕨中分离得到苯丙氨酸解氨酶基因家族的三个成员,分别命名为Df PAL1、Df PAL2、Df-PAL3。保守片段长度均为880 bp,三者之间的序列一致性为84.30%,Gen Bank序列号分别为:KF830704,KJ634145,KJ634146。通过Blastx分析得知,Df PAL1、Df PAL2和Df PAL3与已知序列的一致性分别为97%、96%及97%。5.通过Real-Time PCR方法对Df PAL基因家族及Df C4H基因在不同组织部位及不同处理条件下进行表达量的检测。结果分析可知,Df PAL3在配子体中的表达量最高,叶柄中次之,在孢子中的表达量最低,而Df PAL1和Df PAL2在这些部位的表达量很低,而且没有什么明显差异。Df C4H的变化趋势与Df P-AL3大致相同。低温、高温以及紫外处理后发现,Df PAL2及Df C4H的表达量均变化较大,而Df PAL1和Df PAL3则表达量比较稳定,且没有明显的差异。6.通过RT-PCR和RACE技术,首次从香鳞毛蕨中克隆出Df PAL3的c DNA全长,大小为2370 bp,ORF长度为1608 bp,编码535个氨基酸,Gen Bank序列号为KJ634146.2,Df PAL3蛋白ID为AID16057.2。生物信息学分析表明,Df PAL3蛋白的分子量、等电点、分子式分别为57.1966 k Da、5.88及C2537H4081N697O767S18,属于稳定的疏水性蛋白;二级结构预测为α型蛋白;蛋白功能区分析显示,Df PAL3蛋白含有PAL的功能区域,是PAL的家族成员之一;亚细胞定位分析表明,Df PAL3蛋白定位于内质网膜的可能性最大;没有发现信号肽,属于非分泌性蛋白;也没有跨膜蛋白的存在;在Df PAL3蛋白的515-528氨基酸之间存在卷曲螺旋结构;对其进行糖基化和磷酸化位点分析显示,包含N-糖基化、O-糖基化及蛋白激酶磷酸化位点个数分别为1、62和25;多重序列比对分析发现,与松叶蕨、水韭、阴地蕨、蕨的相似性分别为73%、74%、77%及93%。系统进化树结果显示,与蕨类植物阴地蕨和松叶蕨的亲缘关系最近,与裸子植物的亲缘关系次之,与被子植物的亲缘关系略远。7.通过RT-PCR和RACE技术,首次从香鳞毛蕨中克隆出Df C4H的c DNA全长为2063bp,ORF长度为1527 bp,编码508个氨基酸,Gen Bank序列号为KF830705.2。Df C4H蛋白ID为AHI17493.2。生物信息学分析预测其分子量、等电点、分子式分别为58.1908 k Da、8.92、C2649H4189N719O719S18;为不稳定的亲水性蛋白;二级结构预测为混合型蛋白;蛋白功能区预测表明,Df C4H蛋白含有细胞色素P450功能区域,是细胞色素P450的家族成员之一;定位分析显示,Df C4H蛋白定位在细胞膜的可能性最大;Df C4H蛋白可能含有信号肽,在N端有膜蛋白的存在;也可能存在卷曲螺旋结构;对其进行糖基化和磷酸化位点分析显示,含有N-糖基化、O-糖基化及蛋白激酶磷酸化位点个数分别为1、36和19;进化分析表明,与藓类植物小立碗藓的亲缘关系最近,与裸子植物次之,与被子植物的亲缘关系略远。8.本文成功构建了植物表达载体p BI121-Df C4H,通过侵花法对拟南芥野生型植株进行遗传转化,利用PCR方法对转基因Df C4H植株进行检测,获得T1代种子。对T1代植株第一代谢产物对香豆酸含量的HPLC检测结果显示,转基因植株中的含量明显高于野生型。通过对黄酮类化合物合成途径的终产物花色素苷含量进行测定,转基因Df C4H植株中花色素苷的含量明显高于野生型中的含量。9.本文成功构建了植物表达载体p BI121-Df CHS,通过侵花法对拟南芥野生型植株进行遗传转化,利用PCR方法对转基因Df CHS植株进行检测,获得T1代种子。通过HPLC方法对T1代植株的第一代谢产物查尔酮含量进行测定,结果显示,转基因Df CHS植株中的含量明显高于野生型。通过对黄酮类化合物合成途径的终产物花色素苷含量进行测定,转基因Df CHS植株中花色素苷的含量明显高于野生型中的含量。
【关键词】：香鳞毛蕨 PAL C4H CHS CHI F3H Real-Time PCR 遗传转化
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2;S567.239
【目录】：

• 摘要12-14
• 英文摘要14-17
• 1 前言17-29
• 1.1 香鳞毛蕨研究概述17-19
• 1.1.1 香磷毛蕨的分布及生态环境17
• 1.1.2 形态解剖学研究17-18
• 1.1.3 化学成分及药理作用18-19
• 1.2 黄酮类化合物的研究概况19-23
• 1.2.1 黄酮类化合物的结构及分类19-20
• 1.2.2 黄酮类化合物的生理活性20-22
• 1.2.3 黄酮类化合物的合成途径22-23
• 1.2.4 蕨类植物黄酮类化合物的研究概况23
• 1.3 黄酮合成途径关键酶的研究进展23-27
• 1.3.1 苯丙氨酸解氨酶的研究进展23-24
• 1.3.2 肉桂酸 4-羟化酶(C4H)的研究进展24-25
• 1.3.3 查尔酮合成酶(CHS)的研究进展25-26
• 1.3.4 查尔酮异构酶(CHI)的研究进展26-27
• 1.3.5 黄烷酮3羟化酶(F3H)的研究进展27
• 1.4 本研究的目的、意义和技术路线27-29
• 1.4.1 研究目的和意义27-28
• 1.4.2 技术路线28-29
• 2 材料与方法29-56
• 2.1 试验材料及其处理29
• 2.1.1 试验材料29
• 2.1.2 材料的组织培养29
• 2.2 菌株和载体29
• 2.2.1 大肠杆菌菌株29
• 2.2.2 农杆菌菌株29
• 2.2.3 载体29
• 2.3 主要仪器29-30
• 2.4 主要药品及试剂30-31
• 2.4.1 限制性内切酶30
• 2.4.2 分子量标准30
• 2.4.3 抗生素配置30
• 2.4.4 培养基配置30
• 2.4.5 其他常用试剂30-31
• 2.5 黄酮合成关键酶基因的转录组数据筛选31
• 2.5.1 关键酶基因的筛选31
• 2.5.2 关键酶基因的电子克隆31
• 2.6 黄酮合成关键酶基因片段的克隆及序列分析31-38
• 2.6.1 香鳞毛蕨总RNA的提取31-32
• 2.6.2 RNA纯度及浓度检测32
• 2.6.3 香鳞毛蕨c DNA的合成32
• 2.6.4 Df CHI基因保守片段的克隆及序列分析32-35
• 2.6.5 Df F3H基因保守片段的克隆及序列分析35-36
• 2.6.6 Df PAL基因家族的筛选及序列分析36-37
• 2.6.7 Df C4H基因保守片段的克隆及序列分析37-38
• 2.7 黄酮合成关键酶基因在不同条件下的表达特性分析38-40
• 2.7.1 试验材料的处理38
• 2.7.2 香鳞毛蕨RNA的提取38-39
• 2.7.3 香鳞毛蕨c DNA的合成39
• 2.7.4 Df PAL基因家族及Df C4H实时荧光定量PCR测定39-40
• 2.8 黄酮合成关键酶基因c DNA全长的克隆及序列分析40-48
• 2.8.1 Df PAL3基因c DNA全长的获得40-45
• 2.8.2 Df PAL3基因ORF的生物信息学分析45
• 2.8.3 Df C4H基因c DNA全长的获得45-48
• 2.8.4 Df C4H基因ORF的生物信息学分析48
• 2.9 植物表达载体构建及农杆菌转化48-53
• 2.9.1 Df C4H开放阅读框的获得48
• 2.9.2 Df C4H植物表达载体的构建48-50
• 2.9.3 Df CHS开放阅读框的获得50-51
• 2.9.4 Df CHS植物表达载体的构建51-52
• 2.9.5 拟南芥的种植52
• 2.9.6 农杆菌菌液的制备52-53
• 2.9.7 对拟南芥的遗传转化53
• 2.10 转基因拟南芥的检测及功能分析53-56
• 2.10.1 转基因拟南芥的筛选53-54
• 2.10.2 转基因拟南芥的PCR鉴定54
• 2.10.3 转基因拟南芥第一代谢产物的测定54-55
• 2.10.4 转基因拟南芥生理指标的测定55-56
• 3 结果与分析56-105
• 3.1 基因片段的转录组数据筛选56-60
• 3.1.1 关键酶基因的筛选56-57
• 3.1.2 关键酶基因的电子克隆57-60
• 3.2 黄酮合成关键酶基因片段的克隆及序列分析60-69
• 3.2.1 Df CHI基因片段的克隆及序列分析60-62
• 3.2.2 Df F3H基因片段的克隆及序列分析62-64
• 3.2.3 Df PAL基因家族的筛选及序列分析64-68
• 3.2.4 Df C4H基因保守片段的克隆与序列分析68-69
• 3.3 黄酮合成关键酶基因在不同条件下的表达特性分析69-72
• 3.3.1 Df PAL基因家族及Df C4H的组织特异性表达69-71
• 3.3.2 Df PAL基因家族及Df C4H在低温条件下的表达分析71
• 3.3.3 Df PAL基因家族及Df C4H在高温条件下的表达分析71
• 3.3.4 Df PAL基因家族及Df C4H在紫外条件下的表达分析71-72
• 3.4 DFPAL3基因c DNA全长的获得72-74
• 3.4.1 Df PAL3基因片段的克隆72-73
• 3.4.2 通过 3′RACE获得Df PAL3基因的 3′端序列73
• 3.4.3 通过 5′RACE获得Df PAL3基因的 5′端序列73
• 3.4.4 Df PAL3基因c DNA全长的克隆73-74
• 3.5 DFPAL3基因的生物信息学分析74-81
• 3.5.1 Df PAL3基因的c DNA序列及特征74-75
• 3.5.2 Df PAL3基因ORF序列Blastx分析75
• 3.5.3 Df PAL3蛋白一级结构的预测及分析75-76
• 3.5.4 Df PAL3蛋白二级结构的预测及分析76-77
• 3.5.5 Df PAL3蛋白功能区的预测及定位分析77-78
• 3.5.6 Df PAL3蛋白的信号肽预测78-79
• 3.5.7 Df PAL3基因编码蛋白质的蛋白跨膜区分析79
• 3.5.8 Df PAL3基因编码蛋白质的卷曲螺旋预测79
• 3.5.9 Df PAL3基因编码蛋白质的糖基化位点分析79-80
• 3.5.10 Df PAL3基因编码蛋白质的磷酸化位点预测80
• 3.5.11 Df PAL3基因编码蛋白三级结构的预测及分析80-81
• 3.5.12 Df PAL3基因编码蛋白质的多重比较及系统进化树构建81
• 3.6 DFC4H基因c DNA全长的获得81-87
• 3.6.1 Df C4H基因保守片段的克隆与序列分析81
• 3.6.2 通过 3′RACE获得Df C4H基因的 3′端序列81-86
• 3.6.3 通过 5′RACE获得Df C4H基因的 5′端序列86-87
• 3.6.4 Df C4H基因ORF的克隆87
• 3.7 DFC4H基因的生物信息学分析87-98
• 3.7.1 Df C4H基因的c DNA序列及特征87-89
• 3.7.2 Df C4H基因ORF序列Blastx分析89
• 3.7.3 Df C4H蛋白一级结构的预测及分析89-90
• 3.7.4 Df C4H蛋白二级结构的预测及分析90-91
• 3.7.5 Df C4H蛋白功能区的预测及定位分析91-92
• 3.7.6 Df C4H基因编码氨基酸的信号肽预测92
• 3.7.7 Df C4H基因编码氨基酸的蛋白跨膜区分析92
• 3.7.8 Df C4H基因编码氨基酸的卷曲螺旋预测92-93
• 3.7.9 Df C4H基因编码氨基酸的糖基化位点分析93-94
• 3.7.10 Df C4H基因编码氨基酸的磷酸化位点预测94
• 3.7.11 Df C4H基因编码蛋白三级结构的预测及分析94
• 3.7.12 Df C4H基因编码氨基酸序列多重比较及系统进化树构建94-98
• 3.8 植物表达载体的构建及农杆菌转化98-101
• 3.8.1 Df C4H基因开放阅读框的克隆及表达载体的构建98
• 3.8.2 p BI121-Df C4H植物表达载体的双酶切鉴定98-99
• 3.8.3 p BI121-Df C4H重组质粒导入根癌农杆菌99
• 3.8.4 Df CHS基因开放阅读框的克隆99-100
• 3.8.5 p BI121-Df CHS载体的构建100
• 3.8.6 p BI121-Df CHS的双酶切鉴定100-101
• 3.8.7 p BI121-Df CHS重组质粒导入根癌农杆菌101
• 3.9 转基因拟南芥的检测及功能分析101-105
• 3.9.1 转基因拟南芥的筛选101-102
• 3.9.2 转基因拟南芥的PCR鉴定102-103
• 3.9.3 转基因拟南芥的第一代谢产物的测定103
• 3.9.4 转基因拟南芥的生理指标的测定103-105
• 4. 讨论105-111
• 4.1 香鳞毛蕨黄酮合成关键酶基因的选择105-106
• 4.2 黄酮合成关键酶基因保守序列的克隆及分析106
• 4.3 不同温度及紫外处理对基因表达特性的影响106-108
• 4.4 基因全长的获得及生物信息学分析108-109
• 4.5 基因过表达植株的获得109
• 4.6 过表达基因对代谢产物的影响109-110
• 4.7 提高代谢产物含量的调控因子110-111
• 5 结论111-112
• 6 创新点112-113
• 致谢113-114
• 参考文献114-128
• 攻读博士学位期间发表的学术论文128

【共引文献】

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1 张瑞;杨楠;王英平;任贵兴;;苦荞核心种质芦丁含量测定及成因分析[J];中国农学通报;2008年04期

2 谢腾;刘玉忠;王升;刘谈;康利平;郭兰萍;;新疆紫草PAL,HMGR,PGT基因的过表达和RNA干扰载体的构建[J];中国中药杂志;2014年23期

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1 张庆举;橄榄叶类黄酮合成相关基因cDNA的克隆和生物信息学分析[D];福建农林大学;2011年

2 庞红霞;雪莲细胞培养及二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)基因的分离克隆研究[D];新疆师范大学;2010年

3 张瑞;苦荞黄酮及其降血糖活性研究[D];中国农业科学院;2008年

4 肖霞;甘蓝型油菜反义抑制BnTT5和BnTT8基因家族转化后代的分析[D];西南大学;2010年

5 饶灿;粘毛黄芩CHS基因植物表达载体的构建及其在烟草中的功能验证[D];西南大学;2010年

6 周美亮;大豆MYBZ2转录因子与外源次级信号分子（NO与MeJA）对长春花毛状根长春质碱生物合成的分子调控机理研究[D];四川农业大学;2009年

7 唐亚萍;天山雪莲花青素生物合成关键酶基因的克隆及功能鉴定[D];新疆师范大学;2012年

8 谢腾;新疆紫草次生代谢化合物生物合成研究[D];西南交通大学;2014年

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本文编号：732598