RNA-Seq结合基因网络分析揭示水稻种子萌发的复杂调控过程

发布时间：2017-09-04 08:31

  本文关键词：RNA-Seq结合基因网络分析揭示水稻种子萌发的复杂调控过程

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【摘要】：种子萌发一般是指从种子休眠到植株生长的一个过渡阶段,是植物新一轮生命周期的开始。水稻是世界上最重要的农作物之一,而且其全基因组序列早已公布,研究水稻种子的萌发有利于提高农业生产和后续研究。随着基因测序技术和“组学”的快速发展,全转录组测序成为了研究种子萌发的新工具,但至今仍缺乏相关研究。种子萌发的调控机制虽有相关报道,但对于萌发中多个调控因素共同调控的整个过程还有待进一步研究。为了从整个转录组水平研究水稻种子萌发的过程,我们基于新一代测序平台SOLiD,对粳稻日本晴(Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare)种子浸水0(干燥)、12和48(萌发)h(hour post imbibition,HPI)的胚进行了RNA-Seq研究。基于得到的83,273,725,71,036,373和90,085,278个reads,我P在0,12和48 HPI分R%检n,到了27,847,30,173和30,934个表达基因,这初步说明种子萌发过程中转录活动的增加。差异表达基因分析显示在萌发早期(0-12 HPI)发生显著变化的基因(6,911)明显多于后期(12-48 HPI)变化的基因(3,083),表明浸水前12 h是萌发过程中的重要阶段。基因功能分析表明萌发过程中发生了不同的分子生物学事件。例如,表观修饰、内部结构形态发生和碳水化合物结合相关基因分别在0,12和48 HPI富集。代谢分析表明萌发前期激活了基本的代谢活动,如淀粉相关代谢及细胞壁修饰相关基因表达量显著增加,有利于种子进一步吸水；后期脂类和氨基酸代谢以及光合作用代谢相关表达增加,为萌发后的植株生长作准备。水稻种子特异基因,尤其胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryo abundant,LEA),热激蛋白(heat shock protein 20,HSP20)及种子储存蛋白的编码基因,在萌发中表达量呈下降趋势。LEAs和HSPs在干燥种子中积累可以保护胚,在吸水后显著下降是适应环境的种表现。储存蛋白在吸水后被降解,可能为萌发过程和后期生长提供了代谢中间物和能量。植物激素在种子萌发中具有重要作用,但所有植物激素及它们之间的关系对萌发的整体调控尚未报道。本研究中,我们搜集了八种植物激素的合成和信号通路相关基因,包括脱落酸(abscisic acid, ABA)、赤霉素(gibberellin, GA)、油菜素内酯(brassinosteroid, BR)、乙烯(ethylene, ET)、细胞分裂素(cytokinin, CK)、生长素(auxin)、茉莉酸(jasmonic acid, JA)和水杨酸(salicylic acid, SA).植物激素相关基因表达量的增加/降低趋势某种程度上代表了植物激素对萌发的/正/负调控,表达谱分析结果证实ABA和GA为萌发的负调控和正调控激素,BR也可能为萌发正调控激素,另外几种植物激素的表达谱趋势不明显,不能预测其在萌发中的作用。为了研究植物激素之间的相互作用,我们进行了相关基因的共表达网络分析。网络前十个核心基因中有六个编码磷酸化相关蛋白,表明磷酸化在植物激素及萌发调控中的重要作用。比如,BR与ABA途径通过磷酸化相关的BR不敏感基因2(BR insensitive 2,BIN2)和蛋白磷酸酶2C基因(protein phosphatase 2C,PP2C)相连接,推测BR可能通过BIN2磷酸化PP2C从而抑制ABA的信号传导。其他植物激素如SA,可能与胁迫中的萌发过程相关。转录因子(transcription factor,TF)通过结合顺式作用元件(cis-element)调控基因转录。对收集的TF基因进行层次聚类,结果与整体基因的表达模式一致,可能在萌发中起调控作用。统计分析TF基因表达模式,可将TF分成三类在三个时间点富集的家族。根据共表达基因网络和GO分析,构建TF家族的功能网络,发现三类富集TF家族与该时期的功能变化密切相关。比如,0 HPI富集的PHD、SET和SNF2等TF家族与干燥种子中的表观修饰相关；12 HPI富集的HD-ZIP和M-type等家族与吸水后的内部结构形态发生相关;48 HPI富集的WRKY、AUX/IAA和NAC等家族与脂类代谢和光合作用相关。结合公共数据,我们在水稻胚中鉴定了35个萌发特异的TF基因。因为12 HPI表达量最高的基因即为最可能在萌发中起调控作用的基因,所以从中随机选取7个TF基因,进行qRT-PCR验证。实验结果基本与RNA-Seq数据表达模式一致,这为以后的功能实验研究提供了参考基因。顺式作用元件通过与TF结合调控基因的转录。我们统计了各时期高表达基因中富集的顺势作用元件,结果显示ABRE(ABA responsive element),GARE(GA responsive element)和光反应相关元件分别在0,12和48 HPI富集,这与ABA和GA相关基因的表达变化和萌发中的生理过程一致。总体来说,本研究分析了水稻种子萌发的转录组及功能变化,揭示了萌发是植物激素和转录因子等多种因素共同调控的复杂过程。结果同时表明磷酸化在植物激素相互作用中的重要性,并暗示了表观调控在控制种子休眠中的潜在作用。
【关键词】：种子萌发 水稻 RNA-Seq 调控 网络分析
【学位授予单位】：中国科学院北京基因组研究所
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 致谢5-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 专业词汇中英文对照表12-19
• 1 引言19-42
• 1.1 DNA测序技术19-24
• 1.1.1 新一代测序技术及原理19-23
• 1.1.1.1 SOLiD测序平台20-23
• 1.1.2 三代测序技术比较23-24
• 1.2 基于新一代测序平台的转录组测序24-28
• 1.2.1 RNA-Seq技术25-26
• 1.2.2 RNA-Seq数据分析流程26-28
• 1.3 基因共表达网络28-30
• 1.3.1 分子生物学相关网络28
• 1.3.2 基因共表达网络28-29
• 1.3.3 基因共表达网络的构建和应用29-30
• 1.4 种子萌发及其研究意义30-33
• 1.4.1 植物的种子30
• 1.4.2 种子萌发的定义和生物学过程30-32
• 1.4.2.1 种子萌发的定义30-31
• 1.4.2.2 种子萌发的生物学过程31-32
• 1.4.2.3 种子萌发过程中的转录和翻译32
• 1.4.3 种子萌发的研究意义32-33
• 1.5 种子萌发的调控33-40
• 1.5.1 种子发育相关蛋白33
• 1.5.2 植物激素对种子萌发的调控33-37
• 1.5.2.1 脱落酸(ABA)34
• 1.5.2.2 赤霉素(GA)34-35
• 1.5.2.3 油菜素类固醇(BR)35
• 1.5.2.4 乙烯(ET)35-36
• 1.5.2.5 生长素(Auxin)36
• 1.5.2.6 细胞分裂素(CK)36
• 1.5.2.7 茉莉酸(JA)36-37
• 1.5.2.8 水杨酸(SA)37
• 1.5.3 转录因子对种子萌发的调控37-39
• 1.5.3.1 植物中的转录因子家族37-38
• 1.5.3.2 植物激素相关的转录因子38
• 1.5.3.3 转录因子数据库38-39
• 1.5.4 顺式作用元件39-40
• 1.5.4.1 顺式作用元件的种类39
• 1.5.4.2 顺式元件相关网站和软件39-40
• 1.6 水稻种子萌发的研究进展40-41
• 1.6.1 水稻的研究价值40
• 1.6.2 水稻种子萌发的研究进展40-41
• 1.7 本课题的研究意义41-42
• 2 材料与方法42-47
• 2.1 取材和测序42
• 2.1.1 水稻种子的萌发42
• 2.1.2 总RNA和mRNA的提取42
• 2.1.3 文库构建和测序42
• 2.2 数据处理和分析42-47
• 2.2.1 序列比对和基因表达量计算43
• 2.2.2 差异表达及层次聚类分析43-44
• 2.2.3 功能注释44
• 2.2.4 种子发育相关基因的表达分析44
• 2.2.5 植物激素相关基因的表达和网络分析44-45
• 2.2.5.1 植物激素途径的基因收集及表达谱分析44
• 2.2.5.2 植物激素相关基因的表达网络分析44-45
• 2.2.6 转录因子的表达统计及网络分析45
• 2.2.6.1 转录因子的基因收集45
• 2.2.6.2 转录因子家族的统计分析45
• 2.2.6.3 构建转录因子家族的功能网络45
• 2.2.7 水稻种子萌发特异转录因子基因的鉴定及验证45-46
• 2.2.7.1 水稻种子萌发特异转录因子基因的鉴定45-46
• 2.2.7.2 qRT-PCR验证46
• 2.2.8 顺式作用元件的富集分析46-47
• 3 结果47-80
• 3.1 水稻种子的萌发情况47
• 3.2 萌发过程中的基因表达分析47-51
• 3.2.1 序列比对47-48
• 3.2.2 基因的表达量统计48-49
• 3.2.3 差异表达基因和表达变化分析49
• 3.2.4 基因的层次聚类和表达分类49-50
• 3.2.5 小结50-51
• 3.3 表达基因的功能分析51-58
• 3.3.1 表达基因的GO注释51-54
• 3.3.2 KEGG代谢通路的相关表达54
• 3.3.3 MapMan和PageMan分析54-58
• 3.3.3.1 MapMan分析54-56
• 3.3.3.2 PageMan分析56-58
• 3.3.4 小结58
• 3.4 水稻种子发育相关蛋白的基因表达58-59
• 3.4.1 SeedGeneDB中水稻种子基因的表达58-59
• 3.4.2 小结59
• 3.5 植物激素相关基因的表达及网络分析59-64
• 3.5.1 植物激素相关基因及通路整理59-60
• 3.5.2 植物激素相关酶的基因表达60-61
• 3.5.3 植物激素相关基因的共表达网络61-63
• 3.5.4 小结63-64
• 3.6 转录因子(TF)的基因表达及功能网络64-72
• 3.6.1 转录因子的层次聚类及表达分类64-66
• 3.6.2 转录因子家族的表达分组66-69
• 3.6.3 转录因子的功能网络69-71
• 3.6.4 小结71-72
• 3.7 水稻种子萌发特异TF基因的筛选及qRT-PCR验证72-76
• 3.7.1 筛选种子萌发特异TF基因72-75
• 3.7.2 qRT-PCR验证75
• 3.7.3 小结75-76
• 3.8 顺式作用元件的富集分析76-80
• 3.8.1 小结79-80
• 4 总结80-82
• 参考文献82-92
• 附录92-103
• 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果103

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1 崔o，

本文编号：790442