核膜BK通道调节神经元核钙依赖性的基因表达及树突分支

发布时间：2017-09-05 07:05

  本文关键词：核膜BK通道调节神经元核钙依赖性的基因表达及树突分支

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【摘要】：离子通道广泛表达于细胞的磷脂膜结构上,包括细胞膜,线粒体,内质网,溶酶体,以及细胞核膜等,并在细胞的多种生理活动中起到重要的调控作用。在神经元生理和病理过程中,离子通道一直是研究的焦点。在神经元胞膜上的离子通道参与神经元的动作电位的产生和传递,以及神经递质的释放。亦有的研究报道,在神经元细胞内部,线粒体、溶酶体膜上有离子通道的表达,它们调节细胞内钙离子库的钙离子释放,影响细胞的应激反应、细胞凋亡等多种生理或病理过程。虽然细胞内各种细胞器上的离子通道已经受到许多科研工作者的关注,并得到大量研究,然而表达在细胞核膜上的离子通道和它们的生理意义却仍然不清楚。细胞核常常被认为是基因表达的控制中心。组成细胞核的主要结构便是细胞核膜的双层磷脂膜结构——细胞核内膜与细胞核外膜。近期的研究表明,核内膜与核外膜之间包绕形成核周隙含有高浓度的钙离子,是细胞内的一个独立于内质网之外的功能性的钙离子库。这些钙离子可以通过细胞核膜上的InsP3Rs或RyR等钙离子通道被释放到细胞核浆中,使细胞核钙离子浓度升高。细胞核周隙有可能通过控制细胞核钙离子水平参与对细胞核内的基因表达的调节。但是目前为止,有哪些具体机制参与对细胞核周隙钙离子释放的调控仍然不清楚。我们研究组的前期工作证实了在海马神经元的细胞核膜上,表达有功能完整的大电导钙激活钾通道(BK通道),这些细胞核膜BK通道能够调节核膜电位,并且调控核周隙钙离子的释放,影响细胞核内的钙离子浓度。大量研究表明,细胞核钙离子信号对于调节神经活动依赖性的基因表达具有重要意义,并且介导一些长时程的适应性改变,包括对突触的形成和树突复杂程度的调节,对突触可塑性以及记忆的巩固过程的调节。在神经发育、神经可塑性、长时程记忆的形成,以及神经元细胞存活等许多生理过程中,神经活动通过钙离子信号引起环化腺苷酸效应原件结合蛋白CREB的钙信号依赖性的活化,进而调节这些生理过程。CREB是一个定位于细胞核内的转录因子,那么必须存在某一种钙离子敏感性的信号通路将突触部位细胞浆的钙信号传递到细胞核内并引起CREB的磷酸化。因此,在这里我们深入探讨了在神经元兴奋-转录偶联过程中,细胞核膜BK通道对于调节神经活动依赖性的基因表达的作用。本研究发现,神经元核膜BK通道通过影响细胞核周隙的钙离子释放,调节CaMKIV依赖性的细胞核钙离子信号通路,进而调控神经元活动诱导的CREB转录因子的活化,以及下游靶基因的表达,并且影响了神经元树突分支。1.核膜BK通道通过CaMKIV依赖性的细胞核钙离子信号通路调节CREB的磷酸化。我们前期的研究工作提示核膜BK通道能够调节CREB转录因子的转录活性,并且这一作用可能是通过控制细胞核钙离子浓度来实现的。于是我们首先探讨了核膜BK通道是否通过细胞核钙离子信号通路来调控CREB转录活性。CREB的转录活性受到两条钙离子依赖的信号通路的调控,一条是Ca/calmodulin (CAM)-dependent protein kinases通路,特别是定位于细胞核内的CaM kinase Ⅳ(CaMKⅣ),另一条是MAP kinase/extracellular signal-regulated kinase(ERK)信号通路。BK通道的特异性阻断剂paxilline处理分离的神经元细胞核后,用免疫印迹法检测到CREB与CaMKIV磷酸化程度比对照组增强,而ERK的磷酸化没有发生改变。这提示CaMKIV通路可能介导了核膜BK通道对CREB的转录活性的调控作用。为了排除paxilline可能存在的非特异性作用给实验结果带来假阳性,我们同时在BK通道基因敲除(Kcnmal-/-)小鼠的神经元细胞核上平行做了以上实验。结果显示,在Kcnmal-/-小鼠的神经元细胞核,paxilline既没有改变CREB的磷酸化程度,也没有改变CaMKIV或者ERK的磷酸化程度。这说明paxilline对分离细胞核的CREB与CaMKIV的磷酸化的调节作用是特异性地通过BK通道来实现的,而不是通过可能存在的其它非特异性靶点。为了进一步证实CaMKIV信号通路参与核膜BK通道对CREB磷酸化的调节作用,我们分别用CaMKIV信号通路的特异性抑制剂STO-609来阻断CaMKIV信号,和ERK信号通路的特异性抑制剂U0126来阻断ERK信号通路,免疫荧光染色结果显示,在分离的功能完整的细胞核上,CaMKIV信号通路的阻断剂STO-609有效地阻断了paxilline诱导的CREB磷酸化的升高(P=0.007),而ERK信号通路的阻断剂U0126没有影响paxilline对CREB磷酸化的促进作用。这提示CaMKIV信号通路,而非ERK信号通路,介导了核膜BK通道对CREB磷酸化的调节作用。除了分离的细胞核外,我们在完整的培养海马神经元上也进行了同样的实验。由于在完整细胞上,细胞质膜也表达有大量的BK通道,因此为了排除细胞质膜上BK通道对实验结果造成干扰,所有细胞都用一种BK通道的不能穿透细胞膜的肽类阻断剂IbTx进行了预处理,阻断细胞膜上的BK通道而不影响细胞内的BK通道,以排除在完整细胞上细胞质膜BK通道带来的影响。STO-609阻断了paxilline诱导的CREB磷酸化的升高(P=0.001),而ERK信号通路的阻断剂U0126没有影响这一作用。这些结果证实了核膜BK通道是通过CaMKIV信号通路而非ERK信号通路来调节CREB转录活性。通过对培养神经元外源表达shRNA来降低CaMKIV表达,我们进一步验证了阻断CaMKIV信号通路产生的作用。同样的,在降低CaMKIV表达以后,paxilline不能显著提高CREB磷酸化程度(P=0.792),进一步证明CaMKIV介导了核膜BK通道对CREB磷酸化的调节作用。此外,我们通过另外两种方式抑制CaMKIV依赖性的细胞核钙信号通路,一种是外源表达一种定位于细胞核的并且能够螯合钙离子的蛋白质PV-NLS(带有核定位序列的parvalbumin)来缓冲细胞核内的钙浓度升高；另一种是外源表达一种CaMKIV的突变体dnCaMKIVK75E,这个突变体已经失去了它的酶活性,因此是CaMKIV的一种显性负性形式,能够竞争性抑制内源性CaMKIV的作用。同样地,在外源表达了PV-NLS或者dnCaMKIVK75E的细胞,paxilline对CREB磷酸化的调节作用减弱了(PV-NLS与dnCaMKIVK75E组均为P=0.000)。以上证据表明,核膜BK通道通过调节核钙浓度,以及CaMKIV依赖的核钙信号通路,调控CREB的磷酸化。2.核膜BK通道参与调控神经元活动诱导的CREB转录因子活化与基因表达。兴奋性突触活动能够诱导细胞核内的转录因子激活和一些基因表达,这个过程称为神经元的兴奋-转录偶联。兴奋-转录偶联在很多生理过程中都发挥着重要作用,诸如神经发育、学习记忆、神经元的细胞存活等等。我们想进一步探讨核膜BK通道是否参与调节神经元兴奋-转录偶联过程,因此我们研究了核膜BK通道是否参与了神经元活动对CREB转录活性与基因表达的调节。我们首先在培养神经元上使用IbTx封闭细胞膜上的BK通道,以排除细胞膜BK通道可能带来的影响后,我们使用GABA受体阻断剂Bicuculine阻断GABA系统对神经元的抑制作用,通过这种手段提高锥体神经元的兴奋活动。bicuculine的处理可以诱导神经元细胞核内钙离子浓度上升,我们通过免疫荧光染色检测到CREB磷酸化也得到增强(P=0.005)。但是经过paxilline预处理过的神经元在接受bicuculine处理后,细胞核钙信号变化以及CREB活性增加幅度都有减弱(P=0.027)。这可能是由于神经活动引发的细胞核钙信号增强依赖于细胞核周隙钙库的充盈,而paxilline预处理促使细胞核周隙的钙离子排出,减少了核周隙钙库中的钙离子,因此减弱了bucuculine引发的细胞核钙信号。这些实验数据说明核膜的BK通道能够调节兴奋活动引起的细胞核钙信号活动以及CREB磷酸化。为了排除paxilline的作用是由于非特异性地结合了BK通道以外的其它靶点的可能性,我们在BK基因敲除小鼠(Kcnmal-/-)培养的海马神经元上做了相同的实验,我们没有检测到paxilline对bicuculine诱导的细胞核钙信号改变有任何影响,也没有检测到paxilline对bicuculine引起的CREB磷酸化产生抑制作用(P=0.623),这些结果表明paxilline的作用是特异性作用于BK离子通道的。为了探讨核膜BK通道是否参与对调节细胞核内钙信号依赖的基因表达的调节,我们选取了一系列对细胞核钙信号敏感的基因作为检测指标。所有神经元用IbTx预处理以排除细胞质膜BK通道的影响后,一部分用paxilline阻断核膜BK通道,另一部分作为对照,然后通过qPCR检测这些基因的mRNA水平,观察它们的表达是否受影响,以判断核膜BK通道是否有可能参与调节细胞核钙信号敏感的基因表达。在基础神经活动水平下,paxilline确实能够增强Fos(P=0.005), Npas4 (P=0.000), Atf3 (P=0.000), Btg2 (P=0.007), Bcl6(P=0.000),以及Ifi206b(P=0.005)等一些神经活动依赖性基因的表达。Paxilline对神经元基因表达的促进的作用可以被CaMKIV信号通路特异性阻断剂STO-609彻底阻断(Fos, P=0.001; Npas4, P=0.001; Atf3, P=0.001; Btg2, P=0.048; Bcl6, P=0.003; Ifi206b, P=0.015).为了更进一步验证核膜BK通道对基因表达的作用,排除paxilline可能存在的非特异性影响,我们同样在Kcnma-/-小鼠的神经元上检测了paxilline是否还能够引起这些活动依赖性基因的表达。我们的实验结果显示在没有BK通道的神经元,paxilline不能引起这些基因表达的改变(Fos, P=0.896; Npas4, P=0.990; Atf3, P=0.896; Btg2, P=0.856; Bcl6, P=0.929; Ifi206b, P=0.929),排除了paxilline非特异性的可能。为了深入探讨核膜BK通道是否参与神经活动活动对基因表达的调节,我们也使用bicuculine去除GABA系统的抑制作用,来提高环路兴奋性,并检测上述基因的表达。bucuculine的作用增强了Fos, Npas4, Atf3, Btg2, Bcl6,以及Ifi206b等基因的表达(Fos, t=-5.330,P=0.006; Npas4, t=-6.149, P=0.004; Atf3, t=-16.864, P=0.000; Btg2, t=-4.959, P=0.008; Bcl6, t=-6.180, P=0.003; Ifi206b,t=-4.648,P=0.010,独立样本t检验),而paxilline预处理则减弱了神经活动引起的基因表达(Fos, t=4.054, P=0.027; Npas4, t=4.868, P=0.008; Atf3, t=6.882, P=0.002; Btg2, t=5.403, P=0.006; Bcl6, t=5.961, P=0.004; Ifi206b, t=6.441, P=0.003,独立样本t检验)。,我们推测这同样是因为paxilline引起核周隙钙库的减少导致钙信号减弱所致。综合这些结果,我们认为在神经元兴奋-转录偶联过程中,核膜BK通道对神经活动引起的核钙信号活动、CREB转录因子的激活,以及下游敏感基因的表达都具有重要的调控作用。3.核膜BK通道通过CaMKIV依赖性的核钙信号通路和CREB介导的基因表达,调节神经元树突分支。神经元树突的几何形态是受到兴奋-转录偶联的高度调节的。前面的工作中我们发现核膜BK通道在神经元的兴奋-转录偶联过程中,介导了神经活动引起的核钙信号活动以及基因表达,那么接下来我们就探讨了核膜BK通道及核钙信号是否调节了树突分支。首先,为了验证细胞核钙信号是否参与了对神经元树突分支的调节,我们对培养的海马神经元分别转染两种质粒使其过表达两种蛋白,一是CaMBP4,它能够竞争性地阻止CaM与钙离子的结合,阻断钙信号活动对CaMKIV信号通路的激活；另一个是前文提到过的dnCaMKIV,它通过显性负性作用减弱CaMKIV的作用。通过这两种手段阻断细胞核钙信号通路的作用,我们使用sholl分析方法发现神经元的树突分支复杂程度降低了,同时树突总长度也有降低(CaMBP4组P=0.044, dnCaMKIV组P=0.022)。这表明神经元细胞核钙信号确实参与对树突分支的调节。为了探讨核膜BK通道是否参与对树突分支的调节,我们将神经元用IbTx预处理以排除细胞膜BK通道的影响之后,给予pxilline以阻断核膜BK通道。sholl分析方法显示树突分支的复杂程度有所增加,而树突总长度也有显著性增加(t=-2.700,P=0.010),这表明核膜BK通道参与对树突分支的调节。为了证明核膜BK通道是通过调控核钙信号来影响树突分支的,我们对外源表达CaMBP4和dnCaMKIV的神经元使用paxilline,但paxilline并没有增加树突分支的复杂程度或总长度,相反,神经元树突分支的复杂程度或总长度显著降低,这证明paxilline对树突分支的复杂程度或总长度的促进作用是通过CaMKIV依赖性的核钙信号介导的。为了进一步验证BK通道对树突分支的作用,排除paxilline药物非特异性的可能,我们使用shRNA减少BK通道的表达,发现神经元树突分支复杂程度与总长度均有增加(t=-3.424,P=-0.002),与paxilline的效果是一致的。STO-609既可以降低神经元基础水平下的树突分支复杂程度与总长度(t=-4.32,P=0.000),也能逆转BK通道的干扰shRNA带来的树突分支复杂程度和总长度的增加(t=7.99,P=0.000),进一步说明核膜BK通道是通过核钙信号来调节树突分支的。为了阐明核膜BK通道是否通过调控其下游基因的表达来调节树突分支,我们首先在核膜BK通道调控的基因中筛选了可能参与调节树突分支的基因。我们分别设计了一系列shRNA来干扰Fos, Npas4, Atf3, Btg2, Bcl6,以及Ifi206b这些核膜BK通道的下游基因的表达,并通过sholl分析方法检测神经元树突分支的复杂程度,检测树突总长度。我们的数据表明,在这六个下游基因当中,抑制Fos, Atf3, Btg2, Bcl6,以及Ifi206b的表达都没有影响树突分支复杂程度或者总长度,而当Npas4基因的表达被干扰,树突分支的复杂程度显著降低,树突总长度也下降(P=0.008)。这提示在核膜BK通道调控的下游基因中,Npas4可能介导了核膜BK通道对树突分支的影响。为了进一步证明核膜BK通道是通过Npas4来调节神经元的树突分支的,我们给培养神经元用IbTx预处理后,给予paxilline抑制核膜BK通道,并用上述shRNA干扰Fos, Npas4, Atf3, Btg2,Bcl6,以及Ifi206b的表达,我们发现只有当Npas4基因的表达被抑制,paxilline诱导的树突分支的复杂程度及树突总长的的增加被逆转(P=0.000),而干扰其他基因表达均没有对paxilline的作用产生影响。这些结果说明,核膜BK通道是通过抑制Npas4基因的表达来调节神经元的树突分支的。上述结果表明,核膜BK通道的一个生理功能是将神经元的突触活动与细胞核钙信号耦联起来,进而调节突触信号从神经元树突向细胞核内的传递过程。我们的研究揭示核膜BK通道是细胞核膜上调节神经活动依赖性核钙信号的一个新的调节因子。以上实验数据用X±SD进行描述,统计分析采用独立样本t检验及One-way ANOVA,实验数据分为两个组的采用了独立样本t检验,实验数据分为三个组或更多的采用了One-way ANOVA,在One-way ANOVA的两两比较中,方差齐时采用LSD检验,方差不齐时采用Dunnett's T3检验,P0.05被认为具差异有统计学意义。统计软件为SPSS 13.0。
【关键词】：离子通道 核钙信号 BK通道 树突分支
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q42;Q78
【目录】：

• 中文摘要3-11
• ABSTRACT11-18
• 前言18-24
• 材料和方法24-35
• 结果35-71
• 讨论71-76
• 参考文献76-82
• 综述82-91
• 参考文献88-91
• 致谢91-92
• 论文发表情况92-94
• 统计学证明94

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本文编号：796517