枸杞LcMKK及LchERF基因的分离及抗逆功能分析

发布时间：2017-09-07 20:37

  本文关键词：枸杞LcMKK及LchERF基因的分离及抗逆功能分析

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【摘要】：干旱、盐碱等逆境胁迫严重影响植物的生长发育。在长期的进化过程中,植物形成了一套主动的防御体系,能够识别并传递逆境信号,启动胁迫应答基因的表达,以抵御不良环境的影响。MAPK级联途径在植物逆境信号传导中起着重要作用。典型的MAPK级联途径包括MAPKKK、MAPKK和MAPK,通过依次磷酸化的方式传递环境信号。MAPKK是MAPK级联途径的关键环节,在信号传导中发挥重要作用。目前为止,虽然已有研究对多种植物中的MAPKKs进行了功能鉴定,但其在MAPK级联途径中所发挥的重要作用仍有待进一步研究。为了研究MAPKK基因在植物中的抗逆分子机制,本研究利用3′-RACE技术首次在枸杞中分离到一个MAPKK基因,命名为LcMKK。qRT-PCR分析表明,PEG、NaCl和4℃处理均能诱导LcMKK的表达,表明LcMKK可能参与非生物胁迫应答。为了进一步研究LcMKK在植物中的抗逆功能,本研究构建了植物表达载体,并转化了烟草。脱水处理后,转基因烟草的失水率及电解质渗出率显著低于野生型烟草。干旱处理后,转基因烟草的种子萌发率、植株存活率、叶绿素含量及抗氧化酶活性均显著高于野生型烟草;而电解质渗出率及活性氧积累量显著低于野生型烟草;此外,转基因烟草中胁迫应答基因的表达量显著升高,其中,转基因烟草中NtERF2的表达量是野生型烟草中的2.6倍。以上结果表明LcMKK过表达增强了转基因烟草的抗干旱能力,该基因在植物抗干旱领域具有良好的应用前景。LcMKK过表达转基因烟草中NtERF2的表达量显著升高,表明LcMKK可能通过调控ERF转录因子增强植株的抗逆性能。鉴于此,本研究利用3′-RACE技术首次在枸杞中克隆了1个ERF基因,命名为LchERF。半定量RT-PCR分析表明,PEG、NaCl处理均能诱导LchERF的表达,表明LchERF可能参与干旱及盐胁迫应答。为了深入研究LchERF在植物抗逆中的功能,构建了植物表达载体,并转入烟草。盐处理条件下,过表达LchERF转基因烟草种子萌发率、植株存活率、叶绿素含量及渗透保护剂脯氨酸的含量显著高于空载体转基因烟草,而H2O2积累量显著低于空载体转基因烟草。以上结果表明LchERF能够提高转基因烟草的耐盐性,该基因在培育新型抗逆植物品种中具有重要应用价值。
【关键词】：枸杞 非生物胁迫 LcMKK LchERF 抗氧化 基因分离
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-11
• 第一章 文献综述11-30
• 1.1 非生物胁迫和生物胁迫11
• 1.2 非生物胁迫对植物生长发育的影响11-13
• 1.2.1 非生物胁迫对植物水分代谢的影响11-12
• 1.2.2 非生物胁迫对植物光合作用的影响12
• 1.2.3 非生物胁迫对植物呼吸作用的影响12
• 1.2.4 活性氧的伤害12-13
• 1.3 植物对非生物胁迫的适应13-17
• 1.3.1 植物形态结构适应13
• 1.3.2 植物的生理生化反应13-16
• 1.3.3 植物非生物胁迫应答信号传导途径16-17
• 1.4 植物MAPK级联途经17-23
• 1.4.1 植物中MAPK级联途径的发现18
• 1.4.2 植物中的MAPKKKs18-19
• 1.4.3 植物中的MAPKKs19-20
• 1.4.4 植物中的MAPKs20
• 1.4.5 MAPK级联途径在植物非生物胁迫中的作用20-22
• 1.4.6 MAPK级联途径在植物生物胁迫中的作用22-23
• 1.4.7 MAPK级联途径与ROS23
• 1.4.8 MAPK级联途径与ERF转录因子23
• 1.5 植物ERF转录因子23-28
• 1.5.1 AP2/ERF转录因子家族的分类24
• 1.5.2 ERF转录因子的结构特征24-26
• 1.5.3 与ERF转录因子结合的顺式作用元件26
• 1.5.4 诱导ERF转录因子表达的因素26-27
• 1.5.5 ERF转录因子在植物逆境胁迫应答中的作用27-28
• 1.6 本研究的目的意义、研究内容28-30
• 1.6.1 研究的目的意义28-29
• 1.6.2 研究内容29-30
• 第二章 枸杞LcMKK基因的分离及功能分析30-80
• 2.1 实验材料与实验设备30-35
• 2.1.1 植物材料30
• 2.1.2 植物材料的培养与处理30-31
• 2.1.3 质粒与菌株31
• 2.1.4 实验所用培养基31
• 2.1.5 实验所用的主要溶液31-33
• 2.1.6 实验所用酶与各种生化试剂33
• 2.1.7 PCR引物33-34
• 2.1.8 主要实验仪器设备34-35
• 2.2 实验方法35-49
• 2.2.1 基本的分子生物学实验35-41
• 2.2.2 LcMKK基因c DNA序列的获得41
• 2.2.3 DNA序列测定41-42
• 2.2.4 植物表达载体pCAMBIA2300-LcMKK的构建42
• 2.2.5 工程农杆菌的制备42-43
• 2.2.6 烟草转基因43-44
• 2.2.7 转基因烟草的分子鉴定44
• 2.2.8 LcMKK基因的表达特性分析44-45
• 2.2.9 Real-time PCR分析45
• 2.2.10 生理指标测定45-49
• 2.3 结果与分析49-74
• 2.3.1 枸杞促有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因LcMKK的分离49-51
• 2.3.2 LcMKK基因的序列分析51-55
• 2.3.3 LcMKK基因在枸杞中的表达特性分析55-57
• 2.3.4 LcMKK转基因烟草的获得及鉴定57-61
• 2.3.5 过表达LcMKK增强转基因烟草的抗脱水能力61-62
• 2.3.6 过表达LcMKK增强转基因烟草的抗干旱能力62-68
• 2.3.7 过表达LcMKK提高了转基因烟草的抗氧化能力68-70
• 2.3.8 过表达LcMKK增强了转基因烟草的抗氧化酶活性70-71
• 2.3.9 过表达LcMKK提高了转基因烟草中胁迫应答基因的表达量71-74
• 2.4 讨论74-78
• 2.5 小结78-80
• 第三章 枸杞LchERF基因的分离及功能分析80-110
• 3.1 实验材料80-83
• 3.1.1 植物材料80
• 3.1.2 质粒与菌株80
• 3.1.3 实验所用培养基80-81
• 3.1.4 实验所用主要溶液81-82
• 3.1.5 酶与各种生化试剂82-83
• 3.1.6 PCR引物83
• 3.2 实验方法83-89
• 3.2.1 基本的分子生物学实验83-85
• 3.2.2 LchERF基因c DNA序列的获得85
• 3.2.3 DNA序列测定85
• 3.2.4 植物表达载体pCAMBIA2300-LchERF的构建85-86
• 3.2.5 工程农杆菌的制备86
• 3.2.6 烟草转基因86
• 3.2.7 转基因烟草的分子鉴定86
• 3.2.8 LchERF基因的表达特性分析86-87
• 3.2.9 高盐处理87
• 3.2.10 种子萌发率测定87
• 3.2.11 根长测定87
• 3.2.12 叶绿素含量测定87
• 3.2.13 H_2O_2含量测定87-88
• 3.2.14 脯氨酸含量测定88-89
• 3.3 结果与分析89-107
• 3.3.1 枸杞ERF转录因子基因LchERF的分离89-91
• 3.3.2 LchERF基因序列及相关生物信息学分析91-95
• 3.3.3 LchERF基因在枸杞中的表达特性分析95-97
• 3.3.4 LchERF转基因烟草的获得及鉴定97-101
• 3.3.5 转基因烟草的抗盐性分析101-106
• 3.3.6 盐胁迫条件下转基因烟草中的生理指标测定106-107
• 3.4 讨论107-109
• 3.5 小结109-110
• 第四章 结论与展望110-113
• 4.1 研究总结110-112
• 4.2 创新点112
• 4.3 展望112-113
• 参考文献113-129
• 发表论文和参加科研情况说明129-130
• 致谢130-131

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 ;Functions and Application of the AP2/ERF Transcription Factor Family in Crop Improvement[J];Journal of Integrative Plant Biology;2011年07期

2 ;A Novel Mitogen-Activated Protein Kinase Gene in Maize (Zea mays),ZmMPK3,is Involved in Response to Diverse Environmental Cues[J];Journal of Integrative Plant Biology;2010年05期

3 ;Expression of MaMAPK Gene in Seedlings of Malus L.under Water Stress[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2006年04期

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本文编号：809731