MADS盒基因NtSVP调控烟草花柄发育的分子机制研究
发布时间:2017-09-18 10:32
本文关键词:MADS盒基因NtSVP调控烟草花柄发育的分子机制研究
更多相关文章: 花柄 MADS-box转录因子 烟草 转录抑制子 BP
【摘要】:花柄是开花植物上连接花与花序主茎的部分,在花发育、果实成熟等过程运输营养成分,是解剖学上重要的器官。同时,作物花柄的长短及其与主茎的夹角直接影响花序和穗的发育和形态,是影响作物产量的重要因素之一。有关花柄发育的研究主要集中在模式植物拟南芥中。目前已鉴定与花柄发育相关的基因包括BREVIPEDICELLUS(BP), ERECTA{ER), CRM1/BIG等转录因子。但是有关其它植物花柄发育的工作还鲜有报道。我们在研究中发现,烟草MADS-box基因NtSVP是烟草花柄发育所必需的,在调控花柄延伸方面发挥重要作用。我们进而对NtSVP进行功能分析,并研究它调控花柄发育的分子机制。主要结果如下:1.与野生型相比,RNA干扰(RNAi)下调NtSVP基因使烟草花柄显著增长,花序结构舒展;而过表达NtSVP导致花序紧凑,花柄长度严重缩短,几乎消失。石蜡切片观察表明,花柄长度的改变是由花柄细胞延伸的变异造成的,与细胞的分裂无关。2.鉴于拟南芥中Ⅰ类KNOX家族的转录因子BP是控制花柄发育的重要因子之一,我们利用实时定量PCR检测了烟草的一个最近的同源基因\NtBPL在转基因植株中的表达情况。结果发现,下调NtSVP使NtBPL的表达量升高。过表达NtBPL使花柄长度增加:而下调NtBPL花柄缩短。NtBPL-RNAi转基因植株中NtSVP表达未发生变化,显微观察发现其花柄长度的改变是由花柄细胞变短引起的。3.为了进一步确定NtSVP和NtBPL的调控关系,我们通过杂交获得了NtBPLNtBPL-RNAi x NtSVP-RNAi杂交植株,发现其花柄缩短,长度接近于NtBPL-KNAi植株花柄,表明两者调控烟草花柄延伸的通路部分重叠,且NtSVP位于NtBPL上游。4.为了解NtSVP是否直接调控NtBPL表达,我们进行了酵母单杂交和凝胶阻滞实验。结果表明,NtSVP蛋白可以直接结合到NtBPL启动子上的CArG-box [C(A/T)8G]元件,说明NtBPL是NtSVP直接的下游靶基因。利用双荧光素酶报告系统进行转录活性分析表明NtSVP是个转录抑制因子,这与NtBPL在NtSVP-OE转基因烟草花柄中表达量显著下降的现象是一致的。5.为了了解NtBPL是通过怎样的路径实现对花柄长度的调控,我们利用安捷伦烟草芯片,比较了NtBPL下调后基因的变化规律。结果发现,有7个赤霉素(GA)相关基因的表达发生了显著地变化,包括5个GA合成基因,CPS, KS, KAO, GA3oxl, GA3ox2。它们的表达均被下调,暗示NtBPL可能通过GA,尤其是调控GA的合成来影响花柄细胞的延伸,从而调控花柄的长度。综上所述,我们的工作发现了调控一个花柄发育的新机制,即NtSVP通过直接调控NtBPL,并进而影响GA的合成,达到调控花柄延伸目的。本工作在拟南芥已知功能基因NtBPL上游,确定了一个MADS-box基因参与花柄发育功能和调控路径,拓展了我们对植物花柄发育知识,对通过改良花柄长度和夹角来改变植物花序和穗型,提高作物产量,具有一定的借鉴意义。
【关键词】:花柄 MADS-box转录因子 烟草 转录抑制子 BP
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:Q943.2
【目录】:
- 博士学位论文评阅人、答辩委员会签名表4-5
- 摘要5-6
- Abstract6-12
- 英文缩略表12-13
- 第一章 引言13-28
- 1.1 MADS-box基因研究进展13-17
- 1.1.1 MADS-box基因简介13-14
- 1.1.2 调控花器官发育的ABCE模型14-16
- 1.1.3 MADS-box基因与开花时间16-17
- 1.2 KNOX家族17-22
- 1.2.1 TALE家族17-18
- 1.2.2 Ⅰ类KNOX基因功能介绍18-20
- 1.2.3 KNOX-BELL间的蛋白互作20-21
- 1.2.4 Ⅰ类KNOX基因功能与激素的联系21-22
- 1.3 GA的生物合成与信号转导22-24
- 1.3.1 GA的生物合成22-23
- 1.3.2 DELLA蛋白23-24
- 1.3.3 GA对细胞分裂和延伸的影响24
- 1.4 花柄的发育研究24-26
- 1.4.1 ERECTA调节花柄发育的模式24-25
- 1.4.2 BP/KNAT1调节花柄发育的模式25-26
- 1.4.3 其他影响花柄发育的基因26
- 1.5 本研究意义内容及技术路线26-28
- 1.5.1 研究内容和意义26-27
- 1.5.2 研究的技术路线27-28
- 第二章 NtSVP对烟草花柄发育的影响28-40
- 2.1 实验材料28-29
- 2.1.1 植物材料28
- 2.1.2 酶及其它实验耗材28
- 2.1.3 菌株与载体28
- 2.1.4 引物28-29
- 2.2 实验方法29-32
- 2.2.1 烟草的种植29
- 2.2.2 烟草基因组DNA的提取29
- 2.2.3 烟草总RNA提取29-30
- 2.2.4 RT-PCR30
- 2.2.5 反转录效率检测30-31
- 2.2.6 实时定量PCR31
- 2.2.7 石蜡切片制备31-32
- 2.2.8 表型观察和组织细胞学分析32
- 2.3 实验结果32-39
- 2.3.1 NtSVP的序列分析32-34
- 2.3.2 NtSVP的组织特异性表达34-35
- 2.3.3 NtSVP转基因烟草的表型35-36
- 2.3.4 NtSVP对烟草花柄发育的影响36-37
- 2.3.5 NtSVP转基因烟草花柄的组织细胞学分析37-39
- 2.4 讨论39-40
- 第三章 NtBPL控制烟草花柄的延伸40-57
- 3.1 实验材料40-41
- 3.1.1 植物材料40
- 3.1.2 酶及其它实验耗材40
- 3.1.3 菌株与载体40
- 3.1.4 引物40-41
- 3.1.5 植物组培所需培养基和激素母液的配制41
- 3.2 实验方法41-48
- 3.2.1 目标基因的克隆41-43
- 3.2.2 农杆菌转化43-44
- 3.2.3 构建NtBPL过表达载体44-45
- 3.2.4 构建NtBPL-RNAi载体45-46
- 3.2.5 烟草转化46-47
- 3.2.6 转基因烟草的PCR鉴定47-48
- 3.3 结果分析48-56
- 3.3.1 NtBPL在NtSVP转基因烟草花柄中表达量检测48-49
- 3.3.2 NtBPL的序列分析49-51
- 3.3.3 NtBPL的时空表达分析51-52
- 3.3.4 NtBPL转基因烟草植株鉴定52-53
- 3.3.5 NtBPL转基因烟草表型观察与分析53-54
- 3.3.6 NtBPL对烟草花柄延伸的影响54
- 3.3.7 NtBPL转基因烟草花柄的组织细胞学分析54-56
- 3.4 讨论56-57
- 第四章 烟草花柄发育过程中NtSVP对NtBPL的调控57-73
- 4.1 实验材料57-58
- 4.1.1 植物材料57
- 4.1.2 试剂及其它实验耗材57
- 4.1.3 菌株与载体57
- 4.1.4 引物57
- 4.1.5 各种试剂和培养基的配制57-58
- 4.2 实验方法58-67
- 4.2.1 转基因烟草的杂交58
- 4.2.2 NtBPL启动子的克隆58-60
- 4.2.3 酵母单杂交60-62
- 4.2.4 NtSVP-MBP融合蛋白的表达62-63
- 4.2.5 凝胶阻滞63-65
- 4.2.6 转录活性分析65-67
- 4.3 实验结果67-72
- 4.3.1 杂交烟草的花柄表型67-68
- 4.3.2 NtBPL启动子的克隆68
- 4.3.3 酵母单杂交68-69
- 4.3.4 凝胶阻滞实验69-70
- 4.3.5 通过双荧光报告系统分析NtSVP的转录活性70-72
- 4.4 讨论72-73
- 第五章 烟草基因芯片分析NtBPL的下游基因73-80
- 5.1 实验材料73
- 5.1.1 植物材料73
- 5.1.2 试剂与耗材73
- 5.2 实验方法73-74
- 5.2.1 实验流程73
- 5.2.2 差异基因的筛选73
- 5.2.3 差异基因的注释和分析73-74
- 5.3 实验结果与分析74-79
- 5.3.1 差异基因的qRT-PCR检测74
- 5.3.2 GO功能富集分析74-76
- 5.3.3 差异基因MapMan分析76-77
- 5.3.4 NtSVP-NtBPL可以通过影响GA来调控花柄延伸77-78
- 5.3.5 CK不参与NtSVP-NtBPL对花柄延伸的调控78-79
- 5.4 讨论79-80
- 第六章 全文结论80-81
- 参考文献81-93
- 致谢93-94
- 作者简历94
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1 崔永兰,张露,黄敏仁;植物MADS盒基因研究进展[J];中国生物工程杂志;2003年09期
2 袁自强,钱晓茵,刘军,刘建东,钱e,
本文编号:874993
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