脂肪间充质干细胞促进血管内皮细胞功能活性的机制研究

发布时间：2017-10-06 12:12

  本文关键词：脂肪间充质干细胞促进血管内皮细胞功能活性的机制研究

  更多相关文章： 间充质干细胞 血管化 内皮细胞 血管内皮生长因子 逆转录

【摘要】：目的：通过研究脂肪间充质干细胞增强血管内皮细胞的功能活性,进一步明确脂肪间充质干细胞促进血管生成的生物学效应,进而验证和了解脂肪间充质干细胞对血管内皮细胞发挥作用的分子机制，探讨AD-MSCs促进HUVECs发挥功能活性的途径,为进一步研究脂肪间充质干细胞及无细胞治疗体系在临床应用奠定基础。方法：第一部分细胞分离培养与鉴定①分离培养脂肪间充质干细胞脂肪组织来自健康女性吸脂者,经组织标本所属人知情。②用诱导液对分离培养的脂肪来源干细胞进行鉴定。诱导其向脂肪细胞及骨细胞方向分化,分别用油红0和茜素红-S检测其向成脂和成骨分化。③通过流式细胞仪明确人脐静脉内皮细胞CD31阳性细胞的百分比。第二部分选取第3-6代生长状态良好的脂肪间充质干细胞,由原来含10%FBS的DMEM高糖培养液换成无血清的DMEM高糖培养液,过夜收集其上清液,离心后加入3%和5%的FBS备用。用含相应浓度FBS的DMEM设立正常对照组,分别进行内皮细胞的增殖实验、划痕实验、Matrigel成管实验、Matrigel三维培养的出茅实验。计数统计表示用均数±标准差(x±SD)差表示,第三部分分子机制研究①用双抗体夹心ELISA去检测收集上清液VEGF浓度；②在Transwell体系间接共培养,观察HUVEC在AD-MSCs的诱导下迁移。③用双抗体夹心ELISA法测定Transwell培养体系中VEGF浓度水平；④分析培养体系中AD-MSCs与HUVECs分泌VEGF勺差异性。⑤提取相应HUVECs的总蛋白和总RNA。进行、Vestern blot检测，测定HIF-1α、VEGF及Cdk5Rap3蛋白的表达；⑥以提取的RNA为模板,转录合成cDNA，进一步进行Real-time PCR,检测HIF-1α、VEGF及Cdk5Rap3的mRNA表达水平。结果：第一部分.①人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和AD-MSCs在10%FBS的DMEM高糖培养液流式鉴定培养下生长良好。②培养的人脐静脉血管内皮细胞细胞免疫组织化学CD31阳性,定位于细胞膜。③FCM结果显示,CD31阳性细胞数占检测总数的98.3%,CD34阳性细胞仅占检测总数的0.016%。④脂肪间充质干细胞能定向诱导成脂肪细胞即骨细胞，油红O和茜素红S检测阳性。第二部分①CCK-8细胞增殖活力检测 用MSC-CM处理的HUVECs 24小时与对照组P值0.01,两者具有显著的统计学意义。培养36小时后,P值0.05,两者有统计学意义。②划痕实验MSC-CM组在前六小时的迁移速率就高于Control组。至12小时，，MSC-CM组细胞侵入面积已达42%,而对照组仅为10%左右。③管腔形成实验中,实验组节点数平均为21个/视野,而对照组为12个/视野,成组T检验得知P0.001,具有极其显著的统计学意义。④出芽实验亦显示,实验组与Control组P=0.004,两者具有极显著的统计学意义。第三部分①脂肪间充质干细胞上清的VEGF浓度与脐静脉内皮细胞上清中VEGF的浓度两者具有显著的统计学意义(P0.01)。迁移实验②Transwells诱导组与对AD-MSC照组两者具有极其显著的统计学意义(P0.001)。③来自组的上清液中AD-MSCs浓度为26.87±2.7VEGF而7pg/mL,组则仅为7.65±1.2Vehicle(表3-6),两者有极其显3pg/mL著的统计学意义(P0.001)。④每1×104个细胞为单位,与HUCVEC-CM之间MS C-CM比较分泌的量有显著的统计学差异(P0.01)：⑤经MSC-CM处理的VRGF其表达HUVECs,蛋白的相对表达量均上调,⑥VEGF、HIF-1α及Cdk5Rap3结果相与Western Blot似，各自的表达均有增加。nRNA结论：可以促进AD-MSCs的生物学增殖、迁移、管腔结构形成效应,其外HUVECs在通过分泌等促进VEGF的功能活性,内在通过调节效应蛋白分子VEGF、H1F-1αHUVECs及3表达。CDK5RAP
【关键词】：间充质干细胞 血管化 内皮细胞 血管内皮生长因子 逆转录
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 缩略词表5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-16
• 第一部分 脐静脉内皮细胞及脂肪间充质干细胞的培养与鉴定16-29
• 材料16-18
• 方法18-22
• 结果22-26
• 讨论26-29
• 第二部分 脂肪间充质干细胞促进血管内皮细胞增殖、迁移及管状结构形成效应29-43
• 材料29-31
• 方法31-35
• 结果35-39
• 讨论39-43
• 第三部分 脂肪间充质干细胞增强血管内皮细胞功能活性的分子机制43-67
• 材料43-46
• 方法46-54
• 结果54-63
• 讨论63-67
• 小结67-69
• 参考文献69-77
• 文献综述77-86
• 参考文献81-86
• 附录一86-97
• 个人简历和研究成果97-99
• 致谢#@@

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 陈莉娜;王颖;张艳艳;关伟军;;间充质干细胞的免疫调节作用[J];中国组织工程研究与临床康复;2007年28期

2 饶圣宏;;间充质干细胞的研究进展[J];赤峰学院学报(自然科学版);2012年09期

3 王佃亮;张艳梅;杜娟;;间充质干细胞过滤分离器制备人羊膜间充质干细胞的研究[J];中国生物工程杂志;2012年10期

4 李陈;肖玉周;;不同来源的间充质干细胞生物学特性差异研究进展[J];创伤外科杂志;2014年01期

5 李丽春;李剑平;;基因转染间充质干细胞的临床治疗:特点与问题[J];中国组织工程研究;2014年14期

6 殷海斌;田新;杨春会;高晓慧;;间充质干细胞的生物学特性及临床应用(英文)[J];中国组织工程研究;2014年14期

7 许琴,朱依纯,肖雁冰,田虹;小鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养[J];遵义医学院学报;2002年02期

8 张明伟,郭子宽,刘晓丹,吴英,侯春梅,毛宁;小鼠骨骼肌源间充质干细胞的分离与培养[J];中国实验血液学杂志;2003年05期

9 李府;间充质干细胞的来源、特性及临床应用前景[J];国外医学(儿科学分册);2004年02期

10 陈光辉 ,王燕,李天德,邵建华;自成人脂肪组织分离与培养间充质干细胞的实验研究[J];解放军医学杂志;2004年06期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 李艳菊;胡亮杉;郭坤元;;间充质干细胞对衰老大鼠睾丸的影响[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年

2 郭勇;张西正;李瑞欣;张春秋;郭春;张彦军;闫玉仙;;力学拉伸对经5-氮胞苷诱导的间充质干细胞向心肌细胞分化的影响[A];第九届全国生物力学学术会议论文汇编[C];2009年

3 李力;王海燕;杜娟;赖洁娟;刘庆;黄苏娜;蒋建新;;直流电刺激对人脐带间充质干细胞物理特性的影响实验研究[A];第七届全国创伤学术会议暨2009海峡两岸创伤医学论坛论文汇编[C];2009年

4 马丽;呼莹;马冠杰;姜学英;赵春华;;小鼠真皮间充质干细胞的生物学特性及对造血恢复的影响[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年

5 韩钦;刘艳宁;何东南;闫曦;曹莹;赵春华;;分离和鉴定小肠上皮干细胞及其可塑性与间充质干细胞的比较[A];第10届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2005年

6 刘晓丹;刘兵;李秀森;毛宁;;人脐带间充质干细胞的分离与培养[A];第11次中国实验血液学会议论文汇编[C];2007年

7 姜玉玲;乔虹;刘梦雪;李强;孙玉倩;张巾超;;瘦素诱导体外培养大鼠脂肪间充质干细胞凋亡[A];2008内分泌代谢性疾病系列研讨会暨中青年英文论坛论文汇编[C];2008年

8 肖娜;郭锦鹏;赵秀华;金文静;卢光t;程腊梅;;不同来源间充质干细胞的生物学特性比较[A];湖南省生理科学会2008年度学术年会论文摘要汇编[C];2008年

9 陈广华;杨婷;付t$t$;苗瞄;金正明;唐晓文;韩悦;何广胜;仇慧英;马骁;陈峰;薛胜利;王荧;孙爱宁;吴德沛;;脐带间充质干细胞治疗糖皮质激素耐药的难治性急性移植物抗宿主病19例分析[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年

10 洪珞珈;赵明明;张宇晶;;间充质干细胞与系统性红斑狼疮[A];2012年全国微循环与血液流变学基础研究及临床应用学术研讨会专题报告及论文集[C];2012年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 满学杰;天津滨海新区建最大间充质干细胞生产基地[N];新华每日电讯;2008年

2 满学杰;津昂赛打造间充质干细胞生产基地[N];医药经济报;2008年

3 第三军医大学西南医院输血科 李忠俊 整理 吴刘佳;间充质干细胞研究又见新方法[N];健康报;2013年

4 上海生科院 上海交大医学院健康科学研究所 曹楷;间充质干细胞：干细胞中的孙悟空[N];上海科技报;2014年

5 记者　陈建强;首家间充质干细胞库在津建成[N];光明日报;2006年

6 记者　冯国梧;细胞产品国家工程中心建设方案获准[N];科技日报;2007年

7 实习生 刘霞;间充质干细胞有望用于面部整形[N];科技日报;2007年

8 本报记者 王新佳;我国“原始间充质干细胞”注射液进入临床研究[N];中国高新技术产业导报;2005年

9 冯国梧;全球首个脐带间充质干细胞库规模化运营[N];科技日报;2008年

10 刘莹清;全球首个脐带间充质干细胞库泰达规模运营[N];北方经济时报;2008年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 陈亮;胰岛素样生长因子1增强骨形态形成蛋白9介导的间充质干细胞成骨分化及成骨作用的研究[D];重庆医科大学;2010年

2 郑宗梅;脂肪间充质干细胞作为骨组织工程种子细胞的实验研究[D];中国协和医科大学;2006年

3 王宪英;脑组织微环境及神经甾体对脐带间充质干细胞分化的影响[D];河北医科大学;2012年

4 李晓东;牙胚间充质干细胞在不同条件下牙向分化的实验研究[D];四川大学;2004年

5 郭虹;胎儿多种组织间充质干细胞生物学特征及胎儿骨髓血液血管干细胞特性的研究[D];中国协和医科大学;2003年

6 侯静;间充质干细胞在辐射损伤后干性维持的机制研究[D];第二军医大学;2013年

7 袁茵;人脐带间充质干细胞对不同类型肿瘤细胞恶性表型的调控作用研究[D];南方医科大学;2014年

8 来晓瑜;一个新的人间充质干细胞特异性表面抗原的鉴定和间充质干细胞亚群生物学特性的研究[D];浙江大学;2009年

9 韩春;牙根发育期相关间充质干细胞生物学特性的研究[D];第四军医大学;2009年

10 孙念政;胎盘间充质干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞及其对糖尿病鼠降糖作用的研究[D];山东大学;2009年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 王敏;羊膜间充质干细胞克隆的分离和生物学特性的研究[D];华东理工大学;2010年

2 苏晓华;牛胎肝间充质干细胞的分离培养及生物学特性研究[D];东北林业大学;2011年

3 邓长卿;脐带间充质干细胞生物学特性及功能研究[D];苏州大学;2011年

4 杨晨;脐带间充质干细胞的分离鉴定[D];吉林大学;2013年

5 马云鹏;应用大块平铺法对人脐带间充质干细胞分离、传代、冻存及复苏的研究[D];河北医科大学;2013年

6 那仁格日勒;溶血磷脂酸抑制人脐带间充质干细胞凋亡及其分子机理[D];内蒙古大学;2013年

7 王黎明;脐带间充质干细胞的分泌蛋白表达谱研究[D];安徽医科大学;2014年

8 唐秋灵;人脐带间充质干细胞向男性生殖细胞分化的研究[D];汕头大学;2008年

9 徐小霞;人胎盘绒毛层间充质干细胞体外培养的优化及生物学特性的初步分析[D];苏州大学;2009年

10 王建军;成人脂肪间充质干细胞体外长期培养及成骨潜能的实验研究[D];兰州大学;2009年

本文编号：982716