基于高内涵技术的肾纤维化体外模型建立及中药化合物筛选

发布时间：2017-12-08 02:23

  本文关键词：基于高内涵技术的肾纤维化体外模型建立及中药化合物筛选

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【摘要】：肾纤维化是各种慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)进展至终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的共同病理过程,其主要特征是持续存在的慢性损伤导致肾脏的固有细胞和结构不断遭到破坏,取而代之的是不断积聚的细胞外基质(extracellular matrix,ECM),进而肾脏正常功能逐渐衰减。现代医学对于慢性肾病、终末期肾病的治疗,尚缺乏行之有效的方法与药物。而中医药在肾纤维化的治疗中显示出了较好的应用前景。目的:本课题依托药物高内涵筛选技术平台,探索建立可用于抗肾纤维化药物高内涵筛选的体外细胞模型,选用文献报道中具有抗肾纤维化功效的化合物进行模型评价和验证。在此基础上对344种中药化合物进行高内涵筛选,以期发现具有抗肾纤维化功效的化合物,为下一步的药物研发和相关机制研究奠定基础。方法:1.肾纤维化体外高内涵药物筛选模型的建立:采用正常大鼠肾成纤维细胞NRK49F作为研究对象,以转化生长因子-β1(TGF-β1)作为诱导剂,分别设置不同细胞种板密度、不同诱导时间以及不同诱导培养基中血清浓度的实验组,以肌成纤维细胞的主要标记物αα-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)为检测指标,通过高内涵分析系统对不同组别NRK49F细胞的α-SMA表达情况进行检测分析,以诱导组与空白对照组α-SMA表达差异最大的组别实验条件作为模型建立的条件。2.肾纤维化体外高内涵药物筛选模型的评价与验证:在确立的模型优化条件下,以TGF-β1受体阻滞剂SB525334和文献报道的具有抗肾纤维化功效的中药化合物姜黄素、大黄素为阳性药物,利用高内涵分析系统检测上述化合物对TGF-β1诱导的NRK49F细胞α-SMA表达的影响。3.抗肾纤维化中药化合物的高内涵筛选:在成功建立细胞模型的基础上,以α-SMA为评价指标,将344种中药化合物进行以10μmol/L的浓度进行初步筛选,从中筛选获取可能具有抗肾纤维化活性的化合物。将筛选获取的化合物分别设置最高浓度为72 μmol/L,3等倍稀释5个浓度梯度的不同实验组,进一步检测分析其对细胞模型中α-SMA和Ⅲ型胶原表达的影响。结果:1.通过对细胞种板密度、诱导时间以及诱导培养基中血清浓度等各种条件进行优化,最终确定了模型建立的条件:细胞接种于96孔板,种板密度为6,000个/孔,将TGF-β1加入到含5%胎牛血清的DMEM培养基,诱导浓度为10 μ g/L,诱导时间为72h。2.TGF-β 1受体阻滞剂SB525334和文献报道的具有抗肾纤维化功效的中药化合物姜黄素、大黄素均能在一定程度上抑制α-SMA的表达,与文献报道结果基本一致。3.通过对实验室344种中药化合物进行筛选,获得了具有抗肾纤维化活性的化合物16种。其中,迷迭香酸对α-SMA以及Ⅲ型胶原的表达无明显影响;贝母素乙、欧前胡素、人参皂苷F2、新橙皮苷有下调α-SMA的表达的趋势,但对Ⅲ型胶原的表达无明显影响;丹酚酸B、丹参素、牛磺酸明显下调Ⅲ型胶原的表达,但对α-SMA的表达无明显影响;姜黄素、大黄素、甘草酸、川芎嗪、羟基红花黄色素A、黄芪甲苷、绞股蓝皂苷、西红花苷则对α-SMA和Ⅲ型胶原的表达均有明显的抑制作用。实验结论:1.通过对肾纤维化细胞模型诱导的条件进行优化,构建了适用于高内涵筛选平台的肾纤维化体外细胞模型,并验证了模型的稳定性,为开展相关药物的研发和机制研究奠定了基础。2.筛选出了十余种具有抗肾纤维化功效的中药化合物,其中甘草酸、羟基红花黄色素A、西红花苷、绞股蓝皂苷等此前未见有抗肾纤维化的研究报道。这几种化合物可作为课题组后期开展体内动物实验研究的候选药物。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R284;R285

【参考文献】

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本文编号：1264702