灯心草菲类成分代谢特征及其对药物代谢酶活性影响研究

发布时间：2017-12-10 08:30

  本文关键词：灯心草菲类成分代谢特征及其对药物代谢酶活性影响研究

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【摘要】：研究背景和目的:灯心草是灯心草科灯心草属植物灯心草(Juncus effsus L.)的干燥茎髓,具有清热通淋、清心除烦的功效。课题组前期研究发现,灯心草中的菲类成分是其抗焦虑的活性成分,且菲类成分以厄弗酚和去氢厄弗酚的含量居多。由于菲类成分的体内外代谢情况尚不明确,为全面阐释菲类成分的代谢特征,本研究在课题组前期对去氢厄弗酚在小鼠体内的药代动力学和代谢过程研究的基础上,研究菲类成分去氢厄弗酚和厄弗酚的代谢特征及其与肝药酶的相互作用,为菲类成分的新药开发奠定基础。方法:1采用HPLC-ESI-MS2分析小鼠灌胃给予菲类成分厄弗酚后的血液、尿液和粪便中的代谢产物,推测厄弗酚在小鼠体内可能的代谢途径。2采用钙沉淀法制备小鼠肝微粒体,考马斯亮蓝法测定其蛋白含量;建立去氢厄弗酚和厄弗酚在小鼠肝微粒体中的HPLC检测方法;以孵育时间,小鼠肝微粒体蛋白浓度和底物浓度为考察因素,优化孵育条件,确定最佳孵育体系;同时,结合UPLC-Q-TOF-MS2鉴定去氢厄弗酚和厄弗酚在小鼠肝微粒体中的代谢产物。3采用专属性抑制剂法,分别以α-萘黄酮、噻氯吡啶、槲皮素、磺胺苯吡唑、奎尼丁、二乙基二硫代氨基甲酸钠、酮康唑为CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D2、CYP2E1、CYP3A4的抑制剂,通过加入系列浓度专属性抑制剂共温孵,加等量甲醇作为阴性对照。鉴别参与去氢厄弗酚和厄弗酚代谢的CYP450亚酶。4采用"Cocktail"探针底物法研究去氢厄弗酚和厄弗酚对小鼠肝微粒体CYP450亚酶的体内外活性影响,选择非那西丁、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、氯唑沙宗、睾酮分别作为CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1、CYP3A4的探针底物,分别加入去氢厄弗酚和厄弗酚与探针底物共温孵,考察二者对小鼠肝微粒体CYP540亚酶体外活性影响;将小鼠分为5组,每组5只,分别长期灌胃去氢厄弗酚(5、20mg·kg-1)厄弗酚(5、20mg·kg-1)和等量羧甲基纤维素钠,连续灌胃7天后,断颈处死,制备肝微粒体,采用上述"Cocktail"探针底物法,考察去氢厄弗酚和厄弗酚长期给药后对小鼠体内CYP450亚酶活性的影响。5将小鼠分为5组,每组5只,分别长期灌胃去氢厄弗酚(5、20mg·kg-1)厄弗酚(5、20mg·kg-1)和等量羧甲基纤维素钠,连续灌胃7天后,断颈处死,制备肝胞浆液。以4-硝基苯酚作为SULT1A1反应底物,采用紫外分光光度法测定SULT 1A1的活性。考察去氢厄弗酚和厄弗酚对SULT 1A1活性的影响。结果:1在小鼠血浆、尿液和粪便中共检测出12个代谢产物,多数以硫酸结合、葡萄糖醛酸结合方式存在,少量以同分异构体存在。2所建立HPLC测定方法精密度,准确度,基质效应等均符合生物样品测定要求,在24h内稳定性符合实验要求;最佳孵育体系为:去氢厄弗酚浓度20 μg· mL-1或厄弗酚10 μg · mL-1在包含小鼠肝微粒体蛋白浓度1 mg · mL-1的体系中,37 ℃恒温振荡温孵60 min;去氢厄弗酚在肝微粒体中检测到3个代谢产物,厄弗酚在肝微粒体中检测到1个代谢产物,包括了氧化产物,羟基化产物和同分异构体。3参与去氢厄弗酚代谢的CYP450酶亚型主要是CYP2C8,CYP1A2和CYP2D2;参与厄弗酚代谢的CYP亚酶主要是CYP2C8和CYP2B6。4体外实验结果表明,去氢厄弗酚对CYP2C9的IC50为0.096 μmol · L-1,对CYP2E1 的 IC50 为 115.4 μmol · L-1,对 CYP1A2、CYP2C19、CYP3A4 均无抑制作用;厄弗酚对CYP2C9表现出抑制作用。体内实验结果表明,去氢厄弗酚高剂量组(20mg·kg-1)对小鼠体内CYP1A2、CYP2E1和CYP3A4的活性有抑制的作用;厄弗酚高剂量组(20mg·kg-1)对小鼠体内CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19和CYP2E1的活性有抑制的作用。5长期给药后,去氢厄弗酚给药组(5、20mg·kg-1)均对小鼠体内的SULT1A1活性无明显影响;厄弗酚给药组(5、20mg·kg-1)均对小鼠体内的SULT 1A1活性有显著的诱导作用。结论:实验结果表明,去氢厄弗酚和厄弗酚在肝微粒体中分别检测出3个和1个代谢产物,结合实验室前期对去氢厄弗酚体内代谢研究结果,表明灯心草菲类成分去氢厄弗酚和厄弗酚在体内主要发生以硫酸结合反应为主的Ⅱ相代谢反应,且7位羟基可能是其硫酸结合的主要活性位点;酶亚型鉴定结果显示,在小鼠肝微粒体中,去氢厄弗酚和厄弗酚均是多个CYP450酶亚型参与代谢的化合物,整体上看CYP2C8是去氢厄弗酚和厄弗酚代谢时承担主要代谢作用的CYP450酶亚型;结合体内外抑制实验结果,去氢厄弗酚对小鼠CYP2E1活性具有抑制作用,厄弗酚对小鼠CYP2C9活性具有抑制作用,同时厄弗酚能诱导小鼠SULT1A1活性。以上研究结果将为全面评价去氢厄弗酚和厄弗酚的代谢特征提供科学参考,并为归纳灯心草菲类成分类化合物基于药物代谢酶的代谢特征提供依据。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】

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