n-3不饱和脂肪酸通过激活Nrf2-ARE信号通路对6-OHDA及α-synuclein帕金森病模型小鼠的保护作用

发布时间：2017-12-12 14:26

  本文关键词：n-3不饱和脂肪酸通过激活Nrf2-ARE信号通路对6-OHDA及α-synuclein帕金森病模型小鼠的保护作用

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【摘要】：[研究背景]帕金森病(Parkinson's Disease.PD)是世界第二大进行性神经退行性疾病,是发病最多的运动障碍疾病。PD的主要病理特征为黑质致密部部位多巴胺能神经元退行性变性和死亡以及包含错误折替α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)的路易氏体的形成。目前PD的发病机制仍不清楚,研究表明有多种损伤机制参与其中,氧化应激、神经炎症、突触核蛋白稳态、线粒体功能障碍等都参与了 PD发病过程中多巴胺能神经元的损伤。Nrf2-ARE信号通路是细胞抵抗氧化应激损伤最重要的内源性通路之一。其在PD中所发挥的作用逐渐成为近年来的研究热点之一。Nrf2(Nuclear transcription factor NF-E2-related factor 2)转录升高时可诱导抗氧化反应元件(Antioxidant responsive element,ARE)相关蛋白转录,从而对抗细胞氧化应激反应产生的损伤,起到保护作用。正常生理状态下,Nrf2存在于细胞质中。当受到氧化应激时,Nrf2进入细胞核与特定的DNA位点ARE结合,启动相关保护蛋白如血红素加氧酶(Heme oxygenase,HO-1)以及谷胱甘肽(glutathione.GSH)相关调节酶的转录,以此产生对抗活性氧产生的氧化损伤。众多研究表明,氧化应激在PD发病过程中发挥重要作用。因此,对抗活性氧产生的损伤是PD的一个重要的治疗方向。Nrf2-ARE信号通路作为机体最重要的抗氧化通路,在对抗氧化应激损伤方面具有重大潜力。激活该通路可为PD的治疗提供新策略。寻找一种副作用少的高效Nrf2诱导剂可为PD病人提供更高的生活质量。n-3 不饱和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids,n-3 PUFAs)是人体一种重要的脂肪酸,参与了大脑的发育以及视网膜的组成,n-3 PUFAs主要包括DHA(Docosahexaenoicacid)和 EPA(EicosapentaenoicAcid)等,其中 DHA 是脑内不饱和脂肪酸的主要组成部分,同时DHA也是神经细胞细胞膜的主要成分。研究表明,n-3 PUFAs的摄入可降低PD的发病风险。我们研究n-3 PUFAs是否是通过激活 Nrf2-ARE 信号通路对 6-hydroxydopamine(6-OHDA)及 α-syn 过表达 PD 模型发挥保护作用。[研究目的]研究n-3 PUFAs是否通过激活Nrf2-ARE信号通路对6-OHDA及α-syn过表达PD小鼠模型产生抗氧化应激和抗炎保护作用及作用机制。[研究方法]体外实验:1.给予不同浓度的DHA预处理SH-SY5Y细胞24 h,MTT法检测细胞的增殖情况,观察不同浓度的DHA是否会影响细胞自身的活性。2.分别给予SH-SY5Y和BV2细胞不同浓度的DHA预处理8 h或24 h,用western blot方法检测Nrf2及下游蛋白HO-1的表达情况,观察DHA是否可诱导Nrf2的蛋白表达。并在不同时间点用80 μM的DHA预处理细胞,观察Nrf2及下游蛋白HO-1的表达是否随时间的变化而变化。3.采用6-OHDA损伤SH-SY5Y细胞建立PD氧化应激损伤细胞模型,给予SH-SY5Y细胞不同浓度的DHA预处理8 h,加入100μM的6-OHDA损伤24 h,MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞的凋亡情况和细胞内ROS的变化,采用TUNEL染色观察细胞凋亡情况,评价DHA对细胞的保护作用。4.给予BV2细胞不同浓度的DHA预处理8 h,加入LPS损伤24 h,用real time RT-PCR方法检测细胞内炎症相关因子mRNA水平,观察DHA是否可以减轻LPS诱导的炎症反应。5.采用Nrf2小干扰RNA干扰SH-SY5Y细胞Nrf2的表达,给予SH-SY5Y细胞不同浓度的DHA预处理8 h,用western blot检测Nrf2蛋白表达情况,验证Nrf2 siRNA的干扰效率。并给予SH-SY5Y细胞不同浓度的DHA刺激8 h,加入6-OHDA损伤24 h,使用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。评价DHA对SH-SY5Y细胞的保护作用是否仍然存在,以探索DHA是否是通过激活Nrf2实现其保护作用。体内实验:1.采用单侧纹状体立体定位注射6-OHDA建立PD氧化应激损伤动物模型。C57BL/6小鼠分为正常对照组、6-OHDA模型组、6-OHDA+ n-3 PUFAs 2 g/kg组及6-OHDA+ n-3 PUFAs 4 g/kg组,造模前提前灌胃给药35天。注射6-OHDA 1天后,无痛处死小鼠,取小鼠纹状体,用western blot检测Nrf2蛋白表达情况,观察n-3 PUFAs是否可诱导Nrf2蛋白表达。2.采用单侧纹状体立体定位注射6-OHDA建立PD氧化应激损伤动物模型。C57BL/6小鼠分为正常对照组、6-OHDA模型组、6-OHDA+ n-3 PUFAs 2 g/kg组及6-OHDA+ n-3 PUFAs 4 g/kg组,造模前提前灌胃给药35天。注射6-OHDA 21天后麻醉无痛处死小鼠,心脏灌流,取全脑进行冰冻切片,对黑质和纹状体部位进行酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫组化染色,观察多巴胺能神经元及神经纤维损伤情况。。3.采用单侧纹状体立体定位注射6-OHDA建立PD氧化应激损伤动物模型。C57BL/6小鼠分为正常对照组、6-OHDA模型组、6-OHDA+ n-3 PUFAs 2 g/kg组及6-OHDA+ n-3 PUFAs 4 g/kg组,造模前提前灌胃给药35天。注射6-OHDA 7天及14天后,麻醉无痛处死小鼠,心脏灌流,取全脑进行冰冻切片,对黑质纹状体部位进行GFAP及IBA1荧光染色,观察小胶质细胞和星形胶质细胞的激活情况。4.采用单侧纹状体立体定位注射6-OHDA建立PD氧化应激损伤动物模型。C57BL/6小鼠分为正常对照组、6-OHDA模型组、6-OHDA+ n-3 PUFAs 2 g/kg组及6-OHDA+ n-3 PUFAs 4 g/kg组,造模前提前灌胃给药35天。注射6-OHDA 21天后麻醉无痛处死小鼠,取纹状体部位,用HPLC-MS法检测纹状体内多巴胺(dopamine,DA)及其代谢产物二羟苯乙酸(dihydroxyphnylacetic acid,DOPAC)及高香草酸(homovanillicacid,HVA)含量。5.采用单侧纹状体立体定位注射6-OHDA建立PD氧化应激损伤动物模型。C57BL/6小鼠分为正常对照组、6-OHDA模型组、6-OHDA+ n-3 PUFAs 2 g/kg组及6-OHDA+ n-3 PUFAs 4 g/kg组,造模前提前灌胃给药35天。分别于注射6-OHDA 7天、14天及21天后,对小鼠皮下注射阿扑吗啡诱导小鼠转圈,统计30 min内小鼠逆时针旋转圈数,评价模型小鼠的行为学改变。6.采用单侧黑质立体定位注射AAV-α-syn构建α-syn过表达PD动物模型。C57BL/6小鼠分为正常对照组、6-OHDA模型组、6-OHDA+ n-3 PUFAs 2 g/kg组及6-OHDA+ n-3 PUFAs 4 g/kg组,造模前提前灌胃给药14天。造模后继续灌胃给药21天。造模10周后麻醉无痛处死小鼠,取出全脑,进行冰冻切片,对黑质部位的多巴胺能神经元进行TH荧光染色,观察多巴胺能神经元状态。7.采用单侧黑质立体定位注射AAV-α-syn构建α-syn过表达PD动物模型。C57BL/6小鼠分为正常对照组、6-OHDA模型组、6-OHDA+ n-3 PUFAs 2 g/kg组及6-OHDA+ n-3 PUFAs 4 g/kg组,造模前提前灌胃给药14天。造模后继续灌胃给药21天。分别于造模后14天、21天对小鼠进行旷场试验,观察其行为学变化。[实验结果]1.DHA在0-200 μ范围内不影响SH-SY5Y细胞活性。2.DHA可诱导细胞内Nrf2及HO-1的表达,并且有一定的剂量依赖性。8 h的预处理可以使Nrf2的表达达到最高水平。3.DHA可以减少6-OHDA所致的SH-SY5Y细胞死亡,减轻细胞的凋亡和降低细胞内ROS水平;并且DHA可减轻LPS所致BV2细胞炎症反应。4.Nrf2 siRNA处理后,DHA的保护作用消失。5.n-3 PUFAs可在C57BL/6小鼠中诱导Nrf2表达。并可显著改善6-OHDA PD小鼠黑质纹状体通路多巴胺能神经元的损伤,减轻6-OHDA所致神经炎症,改善小鼠的运动缺陷。6.n-3 PUFAs可显著改善α-syn PD小鼠黑质多巴胺能神经元的减少,减轻小鼠脑内炎症反应,对小鼠的行为学也有一定改善。[结论]n-3 PUFAs可对6-OHDA及α-syn PD小鼠发挥神经保护作用,此作用可能通过激活Nrf2-ARE通路实现。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R742.5;R-332

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本文编号：1282841