甲基苯丙胺诱导α-突触核蛋白磷酸化致异常聚集的神经毒性机制研究

发布时间：2017-12-12 15:22

  本文关键词：甲基苯丙胺诱导α-突触核蛋白磷酸化致异常聚集的神经毒性机制研究

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【摘要】：研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)属于苯丙胺类神经兴奋剂(Amphetamine-Typed Stimulant,ATS),其盐酸盐为透明的结晶体,外观似冰,俗称“冰毒”,在世界范围内被广泛滥用。METH在给人们带来短暂的精神和身体的快感和愉悦之余,是对健康的巨大损害。研究表明,吸食METH能产生很多不利的反应,包括神经毒性,神经心理缺陷以及心血管毒性。大量证据表明,METH主要作用于中枢神经系统,结构与儿茶酚胺类神经递质相似,主要表现为多巴胺等单胺类神经末梢的损伤,可出现与帕金森病(Parkinson's disease,PD)和阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)等神经退行性疾病相似的病理改变。本实验室多年来致力于METH神经毒性分子机制方面的研究,前期研究已经发现在细胞实验中α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)在METH中毒所引起的多巴胺能系统损伤、氧化应激系统失衡和线粒体功能障碍中发挥了重要的作用;α-Syn是由140个氨基酸组成的可溶性非折叠蛋白,是PD特征性病理结构——路易氏小体(Lewy's body)的主要组成部分。近年来研究表明,过表达α-Syn时对神经元有细胞毒性作用,高浓度的cα-Syn可形成β-折叠寡聚物,目前研究认为α-Syn发生异常聚集和纤维化与PD、AD等神经退行性疾病密切相关。METH可诱导神经元出现与上述神经退行性病变相类似的改变,且METH使用者患PD的比率明显升高。前期研究中,我们首次发现METH大鼠中毒模型中前额叶皮质(prefrontαl cortex,pFC)、海马(hippocαmpus,Hipp)及纹状体(corpus striαtum)等相关脑区中α-Syn表达明显升高。建立α-SynRNAi的METH中毒大鼠模型,当α-Syn沉默后,动物异常行为减少,相关指标表明干扰α-Syn表达对氧化应激的损伤和神经元凋亡有保护作用。最近的研究显示METH可以导致小鼠黑质纹状体区产生类似Lewys小体的包涵体,因而抑制α-Syn异常聚集和加速其降解能否减缓神经毒性的产生是目前的研究热点。对PD病人的临床病理学研究中发现,无论是家族性还是散发性病例,其黑质致密部位多巴胺能神经元中α-Syn的丝氨酸磷酸化程度表达都很高。α-Syn的丝氨酸磷酸化主要位于129位点。研究发现α-突触核蛋白129位点的丝氨酸磷酸化(phosphoSer129,pS129 α-Syn)具有促进胞浆内蛋白聚集体形成的作用。目前对磷酸化α-Syn的正常生理功能及如何参与PD发病尚不清楚,大多数的研究认为,磷酸化α-Syn水平增加可以引起多巴胺能神经元的毒性损伤,但METH诱导的磷酸化α-Syn是否是引起异常聚集的主要原因尚不可知,因此深入研究METH诱导的α-Syn磷酸化致异常聚集的神经毒性机制作用具有重要意义。目的:本研究拟通过建立METH中毒的体内外模型,运用分子生物学、神经生物学等技术,初步探讨METH作用后α-Syn 129位点的丝氨酸磷酸化在其寡聚体形成、神经元损伤中的作用。通过siRNA干扰技术,蛋白质印迹、免疫荧光等检测α-Syn、pS129 α-Syn和α-Syn的异常聚集,同时检测凋亡maker基因(Caspase-3和PARP)蛋白表达、线粒体膜电位改变及DA等指标的检测,从而研究METH诱导的α-Syn磷酸化致异常聚集的神经毒性机制,为进一步明确α-Syn在METH神经毒性机制中的重要靶点奠定良好基础。方法:1.METH诱导的α-Syn异常聚集和磷酸化的检测细胞实验,接种SH-SY5Y细胞至96孔板或6孔板中,在37℃和5%CO2条件下培养,待细胞长至70%汇合时,分别使用不同浓度及不同处理时间的含METH的2%FBS培养基培养24 h。检测细胞METH处理后的LC25,LC50;提取细胞总蛋白,Western Blot检测对细胞凋亡等神经毒性进行观察,检测细胞α-Syn聚集体(5G4,α-Syn异常聚集的特异性抗体),pS129 α-Syn蛋白的表达变化情况,选取适宜浓度建立细胞中毒模型。动物实验:参考文献报道及本科室前期造模方法,建立METH亚急性中毒模型。Western Blot 检测细胞 α-Syn、pS 129 α-Syn、cleaved Caspase-3 和 PARP表达情况.2.探究METH诱导的α-Syn磷酸化对异常聚集及其神经毒性的影响(1)沉默PPP2R1a降低磷酸化α-Syn表达:设计并合成三条siRNA干扰序列;采用RNA干扰技术(RNAi)处理SH-SY5Y细胞Western Blot法检测pS129α-Syn检验干扰效率;选择最有效的干扰序列,采用Western Blot法和免疫荧光法检测 α-Syn、pS 129 α-Syn、cleaved caspase-3,cleaved PARP 表达变化;TUNEL法检测各组细胞凋亡情况,JC-1试剂盒检测细胞线粒体膜电位变化情况。(2)BI2536降低磷酸化α-Syn表达:细胞分为5组:空白对照组、对照+DMSO组、对照+BI2536组、给药组和BI2536+给药组,4h后,收集细胞蛋白;Western Blot 法检测 α-Syn、pS 129 α-Syn、cleaved caspase-3 和 cleaved PARP 等表达变化;免疫荧光法检测α-Syn异常聚集变化;小鼠随机分为4组(n=10只/组),对照组、BI2536组、给药组和BI2536+给药组。在METH首次给药前24 h BI2536组和BI2536+给药组给予单次BI2536(50mg/kg,尾静脉注射)。Western Blot 法检测 α-Syn、pS 129 α-Syn、cleaved Caspase-3 和 PARP 等表达变化;酶化学法检测DA的活性变化。3.初步探究METH诱导的磷酸化α-Syn与磷酸化Tau的相互作用及神经毒性的研究免疫荧光检测p-Tau、pS129 α-Syn与p-Tau共表达及使用PLK抑制剂后p-Tau的表达变化。结果:1.METH诱导的α-Syn磷酸化的表达变化及异常聚集的检测(1)0-2.5 mmol/L METH处理的SH-SY5Y细胞,存活率随METH浓度增加逐渐降低,除0.5mmol/L处理组与对照组相比无显著性差异(p0.05)外,其他各浓度处理组与对照组比均有显著性差异(p0.05)。(2)相比对照组,METH处理的SH-SY5Y细胞pS129 α-Syn表达随METH浓度增加逐渐增高,选取METH浓度为2.0 mmol/L,时间为4h,建立中毒细胞模型。(3)使用特异性小鼠抗人α-Syn 5G4抗体标识α-Syn的异常聚集,Western Blot法和免疫荧光法检测结果表明:METH给药后α-Syn异常聚集表达显著增多(p0.01)。(4)Westem Blot法和免疫荧光法检测凋亡Maker基因(Caspase-3和PARP)蛋白表达,相比对照组,METH给药后表达明显升高(p0.05)。(5)METH亚急性中毒模型组Western Blot结果表明α-Syn、pS129 α-Syn、cleaved caspase-3和PARP给药组较对照组表达明显升高(p0.05)。2.探究METH诱导的α-Syn磷酸化对异常聚集及其神经毒性的影响2.1沉默PPP2R1 a在METH诱导的α-Syn磷酸化对异常聚集及其神经毒性中的作用(1)沉默PPP2R1a表达后结果显示均可有效抑制METH引起的pS129α-Syn表达升高。Western Blot法检测发现PPP2R1a沉默后的SH-SY5Y细胞,METH引起的pS129 α-Syn的异常升高被抑制。(2)Western Blot法检测各组细胞α-Syn表达发现:相比Ctrl组,METH组pS129 α-Syn 显著升高(,p0.05),METH+siRNA#1 组细胞内 pS129 α-Syn相比于METH组显著降低(p0.05)。在共聚焦显微镜观察:METH组细胞内α-Syn发生显著聚集,沉默PPP2R1a可有效抑制METH诱导的pS129 α-Syn表达,进而抑制α-Syn的聚集的发生。(3)TUNEL法检测细胞凋亡情况发现:Ctrl+siRNA#1组细胞凋亡与Ctrl组无显著性差异(p0.05),METH组细胞凋亡明显上升(p0.05),METH+siRNA#1组细胞凋亡较METH组表达下降(p0.05；JC-1法检测细胞线粒体膜电位转换情况发现:Ctrl+siRNA#1组细胞较Ctrl组无明显变化(P0.05),METH组细胞线粒体膜电位降低,红绿色荧光比值较降低Ctrl'组明显降低(p0.05),而 METH+siRNA#1 组较 METH 组比值明显升高(p0.05)。2.2 BI2536在METH诱导的α-Syn磷酸化对异常聚集及其神经毒性中的作用(4)BI2536可显著降低METH引起的pS129 α-Syn表达升高,当BI2536浓度为0.4μM时,抑制效果最为显著(p0.01)。(5)Western Blot法检测各组细胞和各脑区,结果发现:SH-SY5Y细胞内METH 组 pS129 α-Syn 的表达相比于 Ctrl 组显著升高(p0.05),BI2536+METH组pS129 α-Syn相比于METH组显著降低(p0.05)。免疫荧光与Western Blot结果一致;BI2536可明显减低METH引起的α-Syn异常聚集表达(p0.05)。3.初步探究METH诱导的磷酸化α-Syn与磷酸化Tau的相互作用及神经毒性的研究(1)相比于空白对照组,METH处理细胞后,p-Tau表达明显升高。双标记免疫荧光检查发现磷酸化α-Syn与磷酸化Tau共定位现象。(2)加入BI2536后,pS 129 α-Syn表达明显降低,同时p-Tau表达也明显降低。结论:1.在METH中毒的细胞及动物模型中,METH诱导α-Syn发生异常聚集,磷酸化α-Syn表达均显著上调并产生神经毒性。2.沉默PPP2R1 a基因或使用PLK抑制剂后可有效减少磷酸化α-Syn的表达,降低异常聚集的神经毒性作用。3.使用PLK抑制剂抑制磷酸化α-Syn的研究中,也发现磷酸化Tau表达也明显降低,提示磷酸化α-Syn是促进Tau磷酸化的重要因素。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：D919.4

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