低糖对肝癌细胞EMT相关迁移的影响及HSF1在其中的作用和机制的研究

发布时间：2017-12-14 20:16

  本文关键词：低糖对肝癌细胞EMT相关迁移的影响及HSF1在其中的作用和机制的研究

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【摘要】：能量代谢重编码是肿瘤的第九大特征,限制葡萄糖供应的饥饿疗法可能是一种安全、有效的治疗方法。然而,葡萄糖饥饿对肝癌细胞恶性表型的影响及相关分子机制目前仍不清楚。本研究采用低糖(LG)和对照高糖(Control)培养基培养肝癌细胞,通过Transwell迁移实验和划痕实验检测低糖对肝癌细胞迁移能力的影响;再用sh RNA干扰HSF1以及HSF1-sh RES基因回补策略,分析HSF1在LG影响肝癌细胞迁移能力中的作用;最后通过生物信息学分析、染色质免疫沉淀技术(CHIP)以及荧光素酶报道基因活性测定进一步探讨相关的分子机制,为肝癌治疗提供新的策略。第一部分低糖对肝癌细胞上皮间质转化(EMT)及迁移能力的影响TGF-β1是上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的有力诱导剂,经5ng/m L TGF-β1处理肝癌细胞48h后,Control组肝癌细胞出现典型EMT样形态学变化,细胞由多边形向成纤维样细胞形态改变,而LG组无显著变化。荧光定量PCR和蛋白印迹方法检测EMT相关的标志物表达情况,Transwell迁移实验和划痕实验测定细胞迁移能力的改变。结果显示,培养细胞48h后,LG组N-cadherin的表达水平较Control组明显降低,而E-cadherin的表达水平较Control组显著增加,差异有统计学意义。Transwell迁移实验结果显示,培养细胞30h后LG组穿膜的细胞数较Control组明显减少,差异有显著性。划痕实验显示与Control组相比LG组划痕的愈合速度明显减慢,且LG组划痕边缘的细胞呈上皮细胞样,而Control组划痕边缘的细胞呈成纤维细胞样。本部分研究表明LG抑制肝癌细胞的EMT样形态学改变,抑制其“钙黏着蛋白转换”及迁移能力。第二部分HSF1在低糖抑制肝癌细胞EMT及迁移能力中的作用HSF1是一个具有促癌作用的多功能转录因子,参与肿瘤细胞的葡萄糖代谢,并促进恶性表型和转移。荧光定量PCR和蛋白印迹显示LG培养持续下调HSF1的表达,推测HSF1可能参与葡萄糖饥饿对肝癌细胞恶性表型的影响。为了确认HSF1是否在低糖条件下肝癌细胞EMT及相关迁移中发挥作用,我们构建了sh HSF1、对照sh NT以及HSF1基因回补(sh RES),并采用荧光定量PCR和蛋白印迹加以验证。荧光定量PCR和蛋白印迹结果显示,转染sh HSF1之后,HSF1表达水平显著降低,说明HSF1基因干扰可信;sh RES组HSF1表达水平较sh HSF1组回升,说明HSF1基因回补策略可抵消干扰作用。此外,通过Transwell和划痕实验观察细胞处理前后肝癌细胞迁移能力的改变。Transwell试验结果显示,与高糖培养相比,低糖培养时Control组和sh NT组穿膜的细胞数明显减少。然而,LG培养条件下,sh HSF1组穿膜的细胞数较Control组和sh NT组显著增加。划痕实验结果与Transwell一致,LG培养条件下,sh HSF1组划痕的愈合速度明显快于Control和sh NT组。本部分研究结果表明,HSF1促进低糖对肝癌细胞EMT及迁移能力的抑制作用。第三部分HSF1在低糖抑制肝癌细胞EMT及迁移能力中的作用机制Snail是EMT过程中的关键转录因子。通过TRED数据库和启动子预测服务器2.0组合,发现Snail基因的启动子序列位于上游的-700bp~299bp。此外,应用转录因子数据库(Transcription Factors Database)对人Snail基因全长序列进行分析,发现Snail启动子区域存在热休克元件(HSE)核心序列5’-n GAAn-3’结合位点。提示Snail可能是HSF1下游的靶标分子,HSF1可能通过直接调控Snail的转录水平来调节Snail的表达。通过染色质免疫沉淀技术(CHIP)和荧光素酶报道基因活性测定加以验证,结果显示:与Control组相比,LG组的相对荧光素酶活性明显增强,而且LG组特异性HSF1抗体结合的DNA产物量明显高于Control组,差异具有显著性。结果表明LG培养条件下HSF1能与Snail启动子结合,在转录水平调节其表达;而Control培养下HSF1与Snail启动子结合能力显著减弱。结论1.低糖抑制肝癌细胞典型的EMT样形态学改变,抑制其“钙黏着蛋白转换”和迁移能力。2.低糖培养持续下调HSF1的表达,HSF1促进低糖对肝癌细胞EMT及相关的转移能力的抑制作用。3.低糖条件下HSF1通过直接调控Snail的转录水平来调节EMT相关分子标记物的表达。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

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本文编号：1289230