龙葵活性成分澳洲茄胺对肠癌细胞生物学行为的影响及其作用机制

发布时间：2017-12-16 08:22

本文关键词：龙葵活性成分澳洲茄胺对肠癌细胞生物学行为的影响及其作用机制

【摘要】：研究目的:澳洲茄胺(Solasodine)是中药龙葵的活性成分,本课题组前期研究发现由龙葵等药物组成的中药灌肠方具有良好的抗肠癌作用,澳洲茄胺是中药灌肠方的有效成分之一,基于临床实践结果及前期实验探索,本课题拟研究澳洲茄胺对分化程度不同的的肠癌细胞株(HCT116、HT-29、SW480)凋亡、侵袭、迁移及相关基因表达的影响,进一步阐明澳洲茄胺抑制肠癌细胞增殖的可能机制,为中医药治疗肠癌提供新的理论依据。研究方法:1采用MTT法,观察澳洲茄胺对人肠癌细胞HCT116、HT-29、SW480的增殖抑制作用。2采用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)研究澳洲茄胺对肠癌HCT116、HT-29、SW480细胞凋亡比例的影响。3 Hoechst 33258染色实验,研究澳洲茄胺对肠癌HCT116、HT-29、SW480染色质形态的影响。4 Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化。5划痕实验检测细胞迁移能力的变化。6采用RT-qPCR法检测澳洲茄胺对肠癌HCT116、HT-29、SW480细胞中凋亡、侵袭转移及AKT/GSK3-β/β-catenin通路基因表达的影响。7采用Western blotting实验检测澳洲茄胺对肠癌HCT116、HT-29、SW480细胞中凋亡、侵袭转移及AKT/GSK3-β/β-catenin通路蛋白表达的影响。8采用免疫荧光实验检测澳洲茄胺对肠癌HCT116、HT-29、SW480细胞中β-catenin胞浆聚集及核易位表达的影响。9 采用 IGF-1 主动调控肠癌 HCT116、HT-29、SW480 细胞 AKT/GSK3-β/β-catenin通路的转录活性,Western blotting实验检测AKT/GSK3-β/β-catenin通路及细胞凋亡蛋白的变化。研究结果:1 MTT实验提示,澳洲茄胺能有效抑制三种分化程度不同的肠癌细胞HCT116、HT-29、SW480增殖,并呈剂量、时间依赖性。2流式细胞术结果提示澳洲茄胺能诱导HCT116、HT-29、SW480细胞凋亡且与浓度呈正相关。Hoechst33258荧光染色实验观察到澳洲茄胺使得细胞核出现核固缩及碎裂。3 RT-qPCR实验结果显示,澳洲茄胺作用于HCT116、HT-29、SW480细胞后,Bcl-2、Bcl-xl、Survivin基因表达下降,Bax、Bak基因表达上升。Western blotting实验结果显示,澳洲茄胺作用于HCT116、HT-29、SW480细胞后,Bcl-2、Bcl-xl、Caspase-9蛋白表达下降,Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-8、Cleaved PARP 蛋白表达上升。4 Transwell小室侵袭实验提示澳洲茄胺作用于HCT116、HT-29、SW480细胞后,穿过小室的细胞数量明显减少,侵袭能力减弱,并呈剂量依赖型;划痕实验检测出3株细胞在药物作用下划痕愈合速度明显减弱,提示细胞迁移能力减弱,与药物浓度相关。5 RT-qPCR实验结果显示,澳洲茄胺作用于HCT116、HT-29、SW480细胞后,MMP-2、MMP-9、MMP-14 基因表达减弱。Western blotting 实验结果显示,MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表达下调,E-cadherin蛋白表达增强。6澳洲茄胺作用有效抑制AKT/GSK3-β/β-catenin通路的活性,RT-qPCR实验显示,AKT、β-catenin基因表达下调,GSK3-β表达上调;Western blotting实验结果显示,澳洲茄胺能下调 AKT、p-AKT、p-GSK3-β、β-catenin 及其核蛋白表达,同时 GSK3-β、p-β-catenin表达增强。免疫荧光实验结果显示澳洲茄胺抑制了肠癌细胞中β-catenin的胞浆聚集与核转移。7 AKT/GSK3-β/β-catenin 信号通路激动剂 IGF-1 作用于肠癌 HCT116、HT-29、SW480细胞后,Western blotting实验结果表明AKT、β-catenin、Bcl-2蛋白表达增多,GSK3-β、Bax、Cleaved PARP表达减弱,提示这条信号通路的活化抑制肠癌细胞的凋亡;而澳洲茄胺单药及澳洲茄胺联合IGF-1作用于3株肠癌细胞后,Western blotting实验结果显示IGF-1部分逆转了澳洲茄胺对AKT/GSK3-β/β-catenin信号通路的抑制以及诱导细胞凋亡蛋白表达的功效,提示澳洲茄胺诱导的肠癌细胞凋亡可能与抑制AKT/GSK3-β/β-catenin信号活性有关。研究结论:1澳洲茄胺能有效抑制人肠癌细胞HCT116、HT-29、SW480增殖并通过增加Bax/Bcl-2 比例、活化 Casβase-3、Casβase-8、Casβase-9、PARP 诱导细胞发生凋亡。2澳洲茄胺能抑制肠癌细胞侵袭迁移,其机制可能与下调MMP-2、MMP-9、MMP-14的表达,上调E-cadherin的表达有关。3澳洲茄胺能抑制AKT/GSK3-β/β-catenin信号通路的激活,其诱导细胞凋亡的机制可能与抑制该通路的激活有关。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R273

【参考文献】

中国期刊全文数据库前10条

1 壮雨雯;周锦勇;吴坚;刘沈林;;澳洲茄胺诱导肠癌HCT-116细胞凋亡的实验研究[J];南京中医药大学学报;2017年01期

2 宋乐乐;李月敏;;大肠癌干细胞相关Wnt信号通路调控分子的研究进展[J];中国肿瘤生物治疗杂志;2015年06期

3 陈来;郭权;金德忠;张洁;李姗姗;黄云;罗小泉;;澳洲茄碱和澳洲茄胺抑制肺癌细胞的构效比较[J];江西中医药;2015年12期

4 壮雨雯;周锦勇;刘沈林;;扶正祛瘀法治疗晚期胃癌之药对举隅[J];环球中医药;2015年09期

5 伊日贵;徐晓艳;李时荣;;肿瘤侵袭转移机制研究进展[J];中华实用诊断与治疗杂志;2014年10期

6 俞晨;许美静;居文政;刘沈林;;灌肠方治疗肠癌有效成分测定[J];辽宁中医药大学学报;2014年05期

7 韦柳婷;冯洁;莫书荣;;PI3K-Akt信号通路与肿瘤相关性的研究进展[J];肿瘤学杂志;2014年04期

8 邵红梅;冯瑞;朱红;谢娟;;中国人群结直肠癌危险因素的Meta分析[J];中国慢性病预防与控制;2014年02期

9 胡兵;安红梅;沈克平;史秀峰;邓珊;魏蒙蒙;;龙葵对人结肠癌RKO细胞粘附、移动和侵袭的影响[J];中药材;2013年06期

10 刘沈林;;大肠癌中医辨治特点与认识[J];江苏中医药;2012年08期