hTNF-α抗体的制备及人鼠嵌合型基因工程抗体的研究

发布时间：2017-12-18 19:08

  本文关键词：hTNF-α抗体的制备及人鼠嵌合型基因工程抗体的研究

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【摘要】：类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种主要表现为软骨和骨损伤的慢性自身免疫性疾病,全球发病率高达0.24%,严重威胁人类的健康。虽然RA的发病机制还不是完全清楚,但是研究者发现遗传、环境、免疫调节异常等因素与它有关。其中,免疫调节异常与RA的关系广受关注。引发和维持介质与调停介质的不平衡是引起免疫调节异常的重要原因,这将导致炎症不受机体控制,进而引发细胞损伤。在RA个体中,这种损伤表现为滑膜、软骨、骨的破坏。肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的分泌异常是导致两种介质处于不平衡状态、引起免疫调节异常并引发RA的重要因素之一,因此受到研究者的广泛关注。TNF-α是一种来源广泛的、具有高度保守性的细胞因子,通过刺激多种细胞来发挥不同的功能。TNF-α抑制剂能够特异性结合TNF-α,阻断其生物活性,进而控制炎症、缓解病情,已在临床上广泛应用。比如英夫利昔单抗、阿达木单抗和依那西普等,但是,由于上述单抗成本高、价格昂贵、操作复杂和免疫排斥等因素限制了它们的应用。因此,需要开发一种成本较低、操作简单和免疫耐受的TNF-α抑制剂。为了开发一种TNF-α抑制剂,本课题通过以人源TNF-α为抗原免疫Balb/c小鼠,制备抗TNF-α的鼠源单克隆抗体。为降低机体对该抗体的免疫排斥,对该抗体进行人源化改造,最终获得一株嵌合型抗体,为后续开发有效的TNF-α抑制剂打下基础。首先,用hTNF-α免疫雌性Balb/c小鼠,通过单克隆抗体技术获得了八株分泌特异性结合hTNF-α的单克隆抗体的杂交瘤细胞,经染色体结构及数量的验证,均符合杂交瘤细胞的特征。对单抗亚型鉴定的结果显示,制备的单抗是IgMκ亚型。挑选其中三株用于制备腹水,用特异性结合免疫球蛋白κ轻链的Protein L对腹水进行纯化。通过BCA法测得纯化后的抗体浓度为2 mg/ml。SDS-PAGE检测结果显示纯化后的单抗纯度较高,Western blot检测结果验证了单克隆抗体为IgM亚型。为了挑选一株合适的杂交瘤细胞株用于后续的基因工程改造,对纯化后的三株单抗进行了亲和力的测定,通过非竞争ELISA法测定单克隆抗体亲和力,最终计算得到2B9E10单抗的Ka = 1.6×108 M-1、3E4C11单抗的Ka =7.698×108 M-1、4H5A10 单抗的 Ka = 5.9×107M-1,细胞株 2B9E10 和 3E4C11 细胞株所分泌的抗体属于高亲和力抗体。故挑选亲和力最高的3E4C11单抗进行基因工程改造。其次,用通用引物调取3E4C11细胞株的轻、重链可变区基因,经过SOEPCR将可变区基因以交联臂(Gly4Ser)3连接,构成单链抗体(ScFv),将其与人源IgG1 Fc段基因序列相连,构建到真核表达载体中。将构建好的载体转染到293T细胞中进行表达,最终Western blot结果显示在胞浆中检测到目的蛋白的表达。通过本课题的研究,我们不仅自主研制出了特异性结合hTNF-α的鼠源性单克隆抗体,并对其进行基因工程改造,获得嵌合型抗体,这为更进一步的人源化改造打下基础,且在TNF-α抑制剂的开发以及RA的治疗方面具有重要意义。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R392

【参考文献】

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1 刘国奇,王海涛;外源蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中高效表达的策略[J];生物化学与生物物理进展;2000年05期

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本文编号：1305280