基于3株相互配对单克隆抗体的胶乳增强免疫比浊检测高尔基体蛋白73方法的建立及其应用研究

发布时间：2017-12-19 09:07

  本文关键词：基于3株相互配对单克隆抗体的胶乳增强免疫比浊检测高尔基体蛋白73方法的建立及其应用研究

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【摘要】：目的肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是目前世界范围内致死率位居第五的恶性肿瘤,也是近年来发病率上升最快的恶性肿瘤之一。HCC的进展快、预后差、恶性程度高,并且临床上诊断为肝癌的患者已多属于中、晚期,使之缺乏有效的治疗手段,术后复发、转移率高,预后效果差,因此肝癌患者的早诊断、早治疗尤为重要。目前,甲胎蛋白(AlphaFetoprotein,AFP)是诊断HCC最重要、最常规的血清学标志物,但其敏感性(39-64%)和特异性(76-91%)不高,使部分的早期肝癌患者无法得到及时地诊断和治疗,无法满足临床肝癌诊断的要求。因此,寻找一种更为理想的肝癌诊断血清学标志物显得非常重要。近年来,有学者发现高尔基体蛋白73(Golgi Protein 73,GP73)在诊断肝癌中的敏感性和特异性均高于AFP,因此,GP73可能成为肝癌早期诊断更为理想的血清学标志物。为了评估其临床应用价值,我们建立了胶乳增强免疫比浊法(Latex Nanoparticle-Enhanced Turbidimetric Immunoassay,LTIA)用于血清中 GP73 的定量检测。我们对胶乳粒子进行了表征,建立了基于多克隆抗体和3株可以两两配对单克隆抗体的LTIA,并对其临床应用进行初步评估。方法(1)胶乳粒子表征。我们采用透射电镜(Transmission Electronic Microscopy,TEM)检测了其粒径大小和形态;采用动态光散射(Dynamic Light Scattering,DLS)检测了其水合粒径和Zeta电位;采用纳米颗粒跟踪分析技术(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)检测了其水合粒径和纳米粒子的浓度;并且采用傅里叶变换红外分析(Ftir-850 Fourier Transform Infrared,FTIR)和电导滴定法测定了其羧基含量。(2)基于多克隆抗体的胶乳增强免疫比浊分析。以GP73多克隆抗体包被胶乳粒子,对胶乳粒子的粒径、1-[3-二甲氨基丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(l-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]Carbodiimide Hydrochloride,EDC)/N-经基琥拍酸亚胺(N-hydroxysulfosuccinimide,NHS)浓度、多抗的浓度、活化胶乳粒子的体积和聚乙二醇6000(Polyethylene Glycol,PEG-6000)浓度等实验条件进行优化,以GP73重组蛋白为标准品建立标准曲线,对实验的精密度、最低检出限、干扰进行分析,并用此方法测定80例健康人和80例肝癌患者血清中GP73含量,进行受试者工作特征曲线(Receive Operating Characteristic Curve,ROC)曲线分析。(3)基于3株单克隆抗体的胶乳增强免疫比浊分析。以3株GP73的单克隆抗体包被胶乳粒子,对EDC/NHS浓度、3株单抗的浓度、活化胶乳粒子的体积和PEG-6000浓度等实验条件进行优化,以GP73重组蛋白为标准品建立标准曲线,对实验的精密度、最低检出限、干扰进行分析,并用此方法测定80例健康人和80例肝癌患者血清中GP73含量,进行ROC曲线分析。结果(1)86 nm和107nm胶乳粒子表面光滑、分散性好;水合粒径和浓度分析结果相差不大;Zeta电位值分别为-39.2和-41.9 mV,其绝对值均大于30 mV,说明这两种胶乳粒子均比较稳定;FTIR显示粒子表面有羧基基团;电位滴定法分析其羧基含量均为0.6 mmol/g。(2)成功建立了基于多克隆的LTIA,该方法的线性范围为20-320 ng/mL,精密度分析得到批内变异系数(Coefficient of Variation,CV)8%,批间CV10%,最低检出限为2.11 ng/mL,满足其对临床样本的检测要求,抗干扰能力强,ROC曲线分析得到其敏感性为94.6%,特异性为72.4%。(3)进一步建立了基于3株单克隆抗体的LTIA,线性范围为10-350ng/mL,精密度分析得到批内CV8%,批间CV10%,最低检出限为1.82ng/mL,满足其对临床样本的检测要求,抗干扰能力强,ROC曲线分析得到其敏感性为96.7%,特异性为93.3%。结论本实验成功建立了基于多克隆抗体和3株单克隆抗体的LTIA,为临床检测GP73提供了新的方法,并且发现应用基于3株两两配对单克隆抗体的LTIA检测GP73时在线性关系、检出限、敏感性和特异性等方面均优于基于多克隆的LTIA方法。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7;R730.43

【参考文献】

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本文编号：1307634