SF-1介导四物合剂药理血清干预顺铂损伤后大鼠卵巢颗粒细胞Cyp19a1活性及表达的研究

发布时间：2017-12-20 01:27

  本文关键词：SF-1介导四物合剂药理血清干预顺铂损伤后大鼠卵巢颗粒细胞Cyp19a1活性及表达的研究　出处：《北京中医药大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的:卵巢是女性主要生殖器官之一,卵泡的发育过程中,颗粒细胞和卵泡膜细胞合成的物质对其进行调控。颗粒细胞和卵泡膜细胞的增殖或功能减退可导致卵泡闭锁增加,从而加速了绝经期的到来,即缩短了妇女的生殖期,导致卵巢功能早衰。本研究拟通过细胞实验,以顺铂(cis-Diaminedichloroplatinum,CDDP)作为卵巢颗粒细胞损伤因素建立化疗源性卵巢颗粒细胞损伤模型,观测四物合剂药理血清对损伤后颗粒细胞分泌E2水平、E2合成关键酶Cyp19al基因表达水平及其基因表达调控通路TGF-β3—Smad3—SF-1的影响,明确四物合剂药理血清对顺铂损伤后卵巢颗粒细胞E2分泌功能的作用效果,揭示其作用机制,从而为四物合剂在临床上用于卵巢早衰的治疗提供实验依据。方法:1.四物合剂药理血清干预顺铂损伤后颗粒细胞中Cyp19al活性及表达卵巢颗粒细胞是卵巢雌激素合成分泌的主要细胞,通过放免法测定细胞培养过程中上清液E2水平,观察顺铂损伤后下和四物合剂药理血清的干预后颗粒细胞分泌E2水平的变化,明确四物合剂药理血清干预顺铂损伤后的卵巢颗粒细胞中Cyp19al活性的作用。E2合成原料为胆固醇,在一系列酶作用下合成雄烯二酮(Androstenedione)转运至颗粒细胞,颗粒细胞中的芳香化酶(Aromatase,Cyp19al)和17β-类固醇脱氢酶(17β-Hydroxysteroid dehydrogenase,17 β-HSD)以雄烯二酮为底物催化生成 E2,其中Cyp19al是E2合成过程及其重要的限速酶。因此本实验通过蛋白印迹和RT-PCR从蛋白质和mRNA水平观察四物合剂干预后顺铂损伤后下的颗粒细胞中Cyp19al的表达变化,从而了解四物合剂影响颗粒细胞E2分泌的机制。2.四物合剂药理血清对SF-1激活Cyp19al基因启动子的干预效果Smad3与SF-1共同作用从而促进SF-1与Cyp19al的PII区域结合来调节Cyp19al的表达。利用染色质免疫共沉淀(ChIP)实验,观察四物合剂药理血清对SF-1激活CyP19al基因启动子的干预效果,实验以SF-1抗体结合颗粒细胞的内源性SF-1蛋白,因SF-1蛋白与Cyp19al PII启动子结合,因而在用微珠结合SF-1抗体时可将Cyp19al PII片段提出,经超声断裂后以PCR凝胶电泳检测CyP19al PII的含量,即可了解各组细胞中SF-1启动Cyp19al表达的效果。通过免疫共沉淀实验(CoIP),以SF-1抗体作为免疫共沉淀抗体,Smad3抗体作为免疫印记抗体,通过观察经SF-1特异性沉淀得到的Smad3水平的变化,了解四物合剂药理血清对干预顺铂损伤后的大鼠卵巢颗粒细胞中,Smad3与SF-1结合从而增强SF-1激活Cyp19al基因启动子的影响效果。3.四物合剂药理血清通过TGF-β3通路干预顺铂损伤后颗粒细胞Cyp19al的活性及表达TGF-p3与受体结合后通过募集并磷酸激活下游的Smad2或Smad3,被激活的Smad3与Co-Smad4结合形成复合体,复合体向核内转运,调控某些基因的表达,Cyp19al即为其靶基因之一。经TGF-β3活化后的Smad3(p-Smad3)入核后,通过其MH2结构域介导与转录因子类固醇生成因子1(Steroidogenic factor 1,SF-1)的相互作用,增强SF-1与Cyp19al启动子的结合提高其转录活性,进而促进Cyp19al的表达和E2的分泌。实验在药理血清干预过程中加入外源性TGF-β3细胞因子刺激颗粒细胞,或加入Smad蛋白阻断剂SB431542阻断Smad蛋白磷酸化,观察四物合剂药理血清对顺铂损伤后的大鼠卵巢颗粒细胞中Cyp19al活性及表达的干预效果。首先,放免法检测各组细胞E2分泌水平,明确四物合剂药理血清通过TGF-β3信号通路干预顺铂损伤后大鼠卵巢颗粒细胞中E2分泌的影响;其次,免疫组化法检测四物合剂药理血清干预顺铂损伤后各组颗粒细胞中Cyp19al表达,明确四物合剂药理血清干预顺铂损伤后颗粒细胞中Cyp19al的活性及表达与TGF-p3信号通路的关系。结果:1.放射性免疫法检测各组颗粒细胞上清液中E2水平,顺铂组颗粒细胞E2分泌水平下降,与顺铂组相比,四物合剂药理血清干预后,细胞中上清液中E2水平明显上升;Western Blot、RT-PCR结果显示四物合剂药理血清组Cyp19al蛋白、mRNA表达水平高于顺铂模型组;2.ChIP实验结果显示,顺铂模型组Cyp19al PⅡ相对表达水平最低,四物合剂干预后Cyp19al PⅡ相对表达水平升高。CoIP实验结果显示,与顺铂模型组相比,四物合剂组Smad3相对表达水平明显升高;3.加入外源性TGF-β3刺激颗粒细胞后,与未加入TGF-β3时比较,四物合剂药理血清干预的顺铂损伤后颗粒细胞E2分泌水平上升,而加入阻断剂后,四物合剂药理血清干预顺铂损伤后颗粒细胞E2分泌水平下降;免疫组化结果显示,TGF-β3组Cyp19al在蛋白质水平上表达高于未加TGF-β3组,而在加入阻断剂后,四物合剂药理血清干预的顺铂损伤后颗粒细胞中Cyp19al表达水平下降。结论:1.四物合剂药理血清可干预Cyp19al基因表达而促进顺铂损伤后的大鼠卵巢颗粒细胞E2分泌。2.四物合剂药理血清能促进顺铂损伤后的大鼠卵巢颗粒细胞中SF-1激活Cyp19al基因启动子的转录从而调节Cyp19al表达,且促进了 Smad3与SF-1协同作用影响Cyp19al基因的转录。3.四物合剂药理血清能影响TGF-β3调节其靶基因Cyp19al的活性与表达,这一过程可能与TGF-β3—Smad3—SF-1信号转导通路有关。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】

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1 阮凡;石吟;李丽洁;;中药补肾养血方联合激素替代法对卵巢早衰患者性激素水平及症状评分的影响[J];中国生化药物杂志;2016年12期

2 孟s，

本文编号：1310245