靶向调控RAC1与鼻咽癌放射敏感性关系的动物实验研究

发布时间：2017-12-20 02:17

  本文关键词：靶向调控RAC1与鼻咽癌放射敏感性关系的动物实验研究　出处：《广西医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的:构建稳定沉默和过表达RAC1基因的低分化鼻咽癌CNE-2细胞系,建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,在体内研究靶向调控RAC1与鼻咽癌放射敏感性的关系,证实RAC1作为鼻咽癌放射治疗增敏靶点的可能性。方法:1.利用RNA干扰和基因过表达基因重组技术,构建沉默和过表达RAC1基因的慢病毒表达载体,感染鼻咽癌CNE-2细胞,通过荧光显微镜和Western blot法筛选出最佳感染条件和最佳沉默靶序列,建立稳定沉默和过表达RAC1基因的鼻咽癌CNE-2细胞系。2.对沉默和过表达RAC1基因的鼻咽癌CNE-2细胞,采用MTT法绘制生长曲线,划痕实验检测细胞迁移能力,流式细胞仪检测细胞周期变化,Western blot法检测RAC1/NADPH信号通路中关键蛋白P67、P47和RAC1的表达情况。3.将沉默和过表达RAC1基因的鼻咽癌CNE-2细胞悬液接种于裸鼠皮下,构建鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,接种14 d给予4 Gy单次照射处理,照射10 d后处死裸鼠。记录裸鼠一般情况、体重和移植瘤重量及体积变化,绘制裸鼠体重变化曲线、移植瘤生长曲线。取瘤体组织,HE染色观察瘤体的病理学变化,免疫组化和Western blot法检测RAC1/NADPH信号通路中RAC1、P67和P47关键蛋白表达情况,透射电镜观察瘤体组织细胞中超微结构的变化。结果:1.成功构建沉默和过表达RAC1基因的慢病毒表达载体,测序结果显示插入序列正确。病毒颗粒转染鼻咽癌细胞后分别获得RAC1沉默的RAC1(-)细胞,RAC1过表达的RAC1(+)细胞,荧光显微镜下观察其感染效率高于95%,Western blot结果显示RAC1(+)细胞RAC1蛋白表达显著高于对照组,RAC1(-)细胞RAC1蛋白表达显著低于对照组。2.体外实验表明,与对照组比较,鼻咽癌RAC1(-)细胞生长增殖速度增加,迁移速度减慢,细胞中P67、P47和RAC1蛋白表达明显下降(P0.05);RAC1(+)细胞增殖速度没有改变,但是迁移速度加快,并上调NADPH氧化酶的关键亚基P67、P47和RAC1蛋白表达(P0.05);但不管是沉默还是过表达RAC1基因,其细胞周期各时相比例无明显改变。3.成功构建鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,成瘤率100%。照射前各组裸鼠体重稳步上升,各组间无统计学差异;裸鼠移植瘤生长迅速,其中RAC1(+)组和RAC1(-)组的瘤体生长速度略快于对照组。但在第14 d进行4 Gy照射后,各组裸鼠体重均下降,尤其是RAC1(-)组体重下降最明显。而各组的瘤体体积均比相应未照射组有不同程度的缩小,其中RAC1(+)和RAC1(-)组的瘤体与照射前相比急剧缩减。裸鼠处死后,照射组移植瘤体重量均比相应不照射组减轻,其瘤重下降率RAC1(+)组最为明显,高达68%。瘤组织的HE染色可见,照射后RAC1(-)组角质纤维化、核固缩明显,RAC1(+)组细胞大面积坏死、核碎裂明显,其他组间差异不明显。Western blot和免疫组化结果显示,RAC1(-)组瘤组织P67、P47和RAC1表达下调,联合照射的RAC1(-)组下调更为明显。RAC1(+)组P67、P47和RAC1表达增高,而联合照射的RAC1(+)组上调更为明显。透射电镜下可以观察到除对照组外,各瘤组织细胞出现出不同程度的超微结构改变,其中照射后RAC1(-)组线粒体肿胀、空泡样改变明显,线粒体内膜和外膜模糊不清,嵴消失,部分嵴融合;而照射RAC1(+)组细胞结构不完整,出现细胞溶解坏死,细胞膜破裂,核碎裂,细胞器损坏消失,可见大量细胞碎片形成。结论:1.成功构建沉默和过表达RAC1基因慢病毒表达载体及沉默和过表达RAC1基因的低分化鼻咽癌CNE-2细胞系。2.沉默或过表达RAC1基因能有效抑制或上调NADPH氧化酶关键亚基P67、P47和RAC1蛋白表达。3.建立了慢病毒介导沉默和过表达RAC1裸鼠鼻咽癌移植瘤模型,体内实验证实,联合4 Gy照射,过表达RAC1能明显增加瘤体对辐射敏感性,RAC1有望成为鼻咽癌放射增敏调控新靶点。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.63

【参考文献】

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本文编号：1310377