木犀草素对流感病毒H1N1感染A549细胞的作用及免疫调节机制的研究

发布时间：2017-12-20 02:23

  本文关键词：木犀草素对流感病毒H1N1感染A549细胞的作用及免疫调节机制的研究　出处：《北京中医药大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的流感病毒是全球范围内危害较高的病原体,常表现为季节性流行,其中甲型流感病毒是造成感染及死亡的主要病原体,较容易通过突变和重配驱动进化发生变异,常会造成灾难性的大流行。流感属中医"外感热病",祖国医学在流感的防治方面积累了很多经验,利用中医药独特的优势研制新型的抗流感药剂,对流感的防治有重要而深远的意义。本实验选用木犀草素是在其原有的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、免疫调节和诱导肿瘤细胞凋亡等药效作用基础上,进一步探究其对流感病毒的作用。我们发现它具有抗病毒作用,因此本实验选用甲型流感病毒H1N1感染肺癌上皮细胞A549细胞株作为体外细胞培养模型,研究木犀草素体外抗流感病毒作用的分子机制。同时利用基因芯片、实时荧光定量PCR和Western-blot等实验方法,筛查出差异表达基因,找到调控的相关炎性细胞因子和细胞凋亡因子等,为木犀草素临床应用提供理论依据。方法1.木犀草素体外对H1N1感染A549细胞作用的影响将A549细胞复苏、传代3-4次。筛选出生长状态良好的细胞培养瓶,调整细胞浓度到1.5×105mL~(-1),小心接种于96孔板中。采用细胞病变效应(CPE)计算出木犀草素抗病毒的活性指数,根据Reed-Muench公式计算出最大无毒浓度(TC0)以及50%细胞中毒浓度(TC50);检测不同时间和作用方式时木犀草素的吸光度,找出木犀草素抗病毒最佳作用方式,并计算出半数抑制浓度(IC50)以及治疗指数(TI)。2.木犀草素体外对流感病毒H1N1诱导炎性细胞因子表达干预作用的影响设置细胞对照组(A)、病毒感染组(B)、奥司他韦对照组(C:0.75mg·L~(-1))、木犀草素高剂量组(D:25mg·L~(-1))和木犀草素低剂量组(E:6.25mg·L~(-1))。细胞对照组不加病毒,其他组均感染流感病毒2h后,吸弃病毒液,用PBS清洗,加入以上各组药物,作用24h后吸弃上清,用PBS清洗1次后,加入细胞裂解液,提取各组总RNA,通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(Western-blot)的方法检测IL-1、IL-10、IFN-y、TNF-a 的 mRNA 的表达变化。3.木犀草素对流感病毒感染细胞TLR信号通路调节作用的影响基因芯片用于筛选流感病毒H1N1感染A549细胞后TLR信号通路的差异表达基因。通过Real-Time PCR和Western-blot检测肺组织Toll样受体3(Toll-like receptor 3,TLR 3)、Toll 样受体 7(Toll-like receptor 7,TLR 7)、髓样分化因子 88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)的 mRNA和蛋白表达的变化。4.木犀草素对流感病毒H1N1感染A549细胞引发凋亡的调控作用设置细胞对照组(A)、病毒感染组(B)、奥司他韦对照组(C:0.75 mg·L~(-1))、木犀草素D组(25mg·L~(-1))和木犀草素E组(6.25mg·L~(-1))。细胞对照组不加病毒,其他组均感染流感病毒2h后,吸弃病毒液,用PBS清洗,加入以上各组药物,作用24h后吸弃上清,用PBS清洗1次后,加入细胞裂解液,放置于一80℃冰箱中冷冻过夜。提取各组总RNA,采用基因芯片技术,查找基因信息功能及生物路径,筛选出与凋亡通路中密切相关的差异表达基因,进行讨论。结果1.木犀草素体外对流感病毒H1N1增殖干预效果的影响木犀草素的半数中毒浓度为39.810μg·mL~(-1),最大无毒浓度为25.0μg·mL~(-1);浓度在12.5-25.0μg·mL~(-1),木犀草素作用48-60 h,对H1N1所致的细胞病变作用有明显的抑制作用。病毒感染后2 h加入25.0μg·mL~(-1)浓度的木犀草素,抗病毒有效率最高为(87.0±1.71)%。计算该条件下木犀草素半数抑制浓度为11.282μg·mL~(-1),治疗指数为3.528。2.木犀草素体外对流感病毒H1N1诱导炎性细胞因子表达干预作用的影响通过KEGG pathway分析涉及炎性因子分泌和转录的变化基因。与细胞对照组(A)相比,病毒感染组(B)差异表达基因TNF-α、IFN-γ、IL-10和IL-1明显上调(P0.01);与H1N1感染组(B)比较,奥司他韦组(C)对差异表达基因IFN-γ、IL-10和IL-1明显下调(P0.01);木犀草素高剂量组(D)对差异表达基因,TNF-a、IFN-γ、IL-10和IL-1明显下调(P0.01);木犀草素低剂量组(E)对差异表达基因,IFN-γ、IL-10和IL-1明显下调(P0.01或P0.05)。RT-PCR结果显示,与细胞对照组(A)比较,H1N1感染组(B)TNF-α、IFN-γ、IL-10和IL-1的mRNA表达均明显升高(P0.01);与H1N1感染组(B)比较,奥司他韦对照组(C)的TNF-α、IFN-γ、IL-10和IL-1的mRNA表达明显降低(P0.01);木犀草素组(D和E)的TNF-α、IFN-y、IL-10和IL-1表达均明显降低(P0.01)。Western-blot 提示,H1N1 病毒感染组(B 组)TNF-α、IFN-γ、IL-10、IL-1蛋白表达较细胞对照组(A)显著升高(P0.01),与H1N1病毒感染组(B组)相比,木犀草素高低剂量组(D和E组)的TNF-α、IFN-γ、IL-10、IL-1蛋白表达不同程度降低(P0.01)。3.木犀草素对流感病毒感染细胞TLR信号通路调节作用的影响通过KEGG pathway分析涉及TLR信号通路的细胞因子。与细胞对照组(A)相比,H1N1 感染组(B)差异表达基因 Myd88、TLR3、TLR7、IRAK4、IRF7、TRAF6明显上调(P0.01);与H1N1感染组(B)比较,奥司他韦对照组(C)对差异表达基因 Myd88、TLR3、TLR7、IRAK4、IRF7、TRAF6 明显下调(P0.01);木犀草素高剂量组(D)对差异表达基因Myd88、TLR3、TLR7、IRF7、TRAF6明显下调(P0.05或P0.01);木犀草素低剂量组(E)对差异表达基因Myd88、TLR7、IRAK4、IRF7明显下调(P0.01)。PCR结果:与细胞对照组(A)比较,H1N1感染组(B)TLR3、TLR7、MyD88的mRNA表达均明显升高(P0.01或P0.05)。与H1N1感染组(B)比较,奥司他韦对照组(C)的TLR3、TLR7、MyD88的mRNA表达明显降低(P0.01或P0.05);木犀草素组(D和E)的TLR3、TLR7、MyD88的mRNA表达均明显降低(P0.01)。Western-blot 提示,H1N1 病毒感染组(B 组)TLR3、TLR7、MyD88蛋白表达较细胞对照组(A)显著升高(P0.01),与H1N1病毒感染组(B组)相比,木犀草素高低剂量组(D和E组)的TLR3、TLR7、MyD88蛋白表达不同程度降低(P0.01)。4.木犀草素对流感病毒H1N1感染A549细胞引发凋亡的调控作用通过KEGG pathway分析信号通路的传导。与细胞对照组(A)相比,病毒感染组(B)差异表达基因 Caspase3、Caspase6、Caspase7、Caspase8、Caspase9、TRAIL、Myd88、IL1 α 和 IL1 β 明显上调,以 TRAIL 尤为明显(P0.01);与 H1N1感染组(B)比较,奥司他韦组(C)对差异表达基因Caspase3、Caspase6、Caspase7、Caspase8、Caspase9 和 Myd88 明显下调(P0.01);木犀草素组(D和 E)对差异表达基因 Caspase3、Caspase6、Caspase7、Caspase8、Caspase9 和Myd88明显下调(P0.01)。RT-PCR提示,与细胞对照组(A)比较,H1N1感染组(B)Caspase3、Caspase8 和 Myd88 的 mRNA 表达均明显升高(P0.01);与 H1N1 感染组(B)比较,奥司他韦对照组(C)的Caspase3、Caspase8和Myd88的mRNA表达明显降低(P0.01);木犀草素组(D和E)的Caspase3、Caspase8和Myd88的mRNA表达均明显降低(P0.01),该结果和基因芯片表达的结果基本相符。结论本实验利用基因芯片、RT-PCR、Western blot方法从基因、mRNA和蛋白质等方面较全面分析了木犀草素对流感病毒H1N1感染A549细胞的干预作用及机制。结果显示,木犀草素对流感病毒的增殖有较强的抑制作用,同时也能有效抑制炎性细胞因子的表达,影响TLR信号通路以及凋亡相关因子的表达,从而减轻病毒对宿主细胞的免疫损伤,减少细胞凋亡,发挥抗病毒的作用。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

【参考文献】

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1 于卓男;林树鹏;顾立刚;吴s，

本文编号：1310407