双重荧光定量PCR方法鉴别阪崎克罗诺杆菌和丙二酸盐阳性克罗诺杆菌

发布时间：2017-12-21 04:14

  本文关键词：双重荧光定量PCR方法鉴别阪崎克罗诺杆菌和丙二酸盐阳性克罗诺杆菌　出处：《吉林大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：克罗诺杆菌属(Cronobacter spp.)细菌是一类极其重要的革兰氏阴性食源性致病菌,该属的细菌可以感染人体引起非常严重的疾病,尤其是在刚出生不久的婴儿中最易发病,其治愈率低且致死性强。最新的分类的研究发现,克罗诺杆菌属细菌包含7个不同的种,分别是阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌(Cronobacter malonaticus)、苏黎世克罗诺杆菌(Cronobacter turicensis)、穆汀斯克罗诺杆菌(Cronobacter muytjensii)、康帝蒙提克罗诺杆菌(Cronobacter condimenti)、尤尼沃斯克罗诺杆菌(Cronobacter universalis)和都柏林克罗诺杆菌(Cronobacter dublinensis)。MLST数据库(http://pubmlst.org/cronobacter)显示,在所有已知的分离到的克罗诺杆菌属菌株中,C.sakazakii和C.malonaticus是数量最多、分布最广的两个种,其中C.sakazakii占分离总数的65.5%,C.malonaticus占分离总数的11.99%,因此关于这两个种的特征以及鉴别方法的研究具有重要意义。在本研究中,我们建立了一套双重荧光定量PCR鉴定体系,将C.sakazakii和C.malonaticus从克罗诺杆菌属菌株中鉴别出来,相比传统的分种方法,本方法用时更少,灵敏度更高。首先,我们利用前人针对克罗诺杆菌属菌株的dnaG基因设计的MMS探针和引物体系,对本研究中用到的112株菌株进行荧光定量PCR实验,鉴定这些菌株是否为克罗诺杆菌属菌株。在确定所用菌株都为克罗诺杆菌属菌株之后,再用我们建立的双重荧光定量PCR体系将C.sakazakii和C.malonaticus这两个种鉴别出来,也就是说双重荧光定量PCR分种方法是在确定菌株为克罗诺杆菌属菌株的基础上进行的。具体而言,根据C.sakazakii和C.malonaticus的fusA基因和16s rRNA基因的特异性序列分别设计了CSM-CTD和CS-CMA两套探针及引物,建立和优化反应体系,对112株克罗诺杆菌属不同种的菌株(包含56株Cronobacter sakazakii,32株Cronobacter malonaticus,16株Cronobacter dublinensis,6株Cronobacter turicensis和2株Cronobacter muytjensii)进行鉴别,评价体系的可靠性,结果显示,我们建立的双重荧光定量PCR体系可以准确的将56株Cronobacter sakazakii和32株Cronobacter malonaticus鉴别出来,结果与用fusA基因分种鉴定结果一致。其次,分别利用Cronobacter sakazakii标准菌株ATCC 29544和Cronobacter malonaticus标准菌株DSM 18702的纯菌核酸和人工污染奶粉模拟样本的核酸进行梯度荧光定量PCR实验检测体系灵敏度。结果显示,CSM-CTD探针和CS-CMA探针对Cronobacter sakazakii标准菌株ATCC 29544纯菌核酸的检测下限均为102 CFU/ml,CSM-CTD探针对Cronobacter malonaticus标准菌株DSM 18702纯菌核酸的检测下限也为102 CFU/ml;CSM-CTD探针和CS-CMA探针对Cronobacter sakazakii标准菌株ATCC 29544人工污染奶粉模拟样本核酸的检测下限为103 CFU/g,CSM-CTD探针对Cronobacter malonaticus标准菌株DSM18702人工污染奶粉模拟样本核酸的检测下限也为103 CFU/g。最后,为了对检测结果进行绝对定量,我们分别将Cronobacter sakazakii和Cronobacter malonaticus标准菌株的CSM-CTD和CS-CMA这两个片段扩增出来,通过将载体质粒导入到感受态细胞,构建质粒标准品并测定其标准曲线。从标准曲线可以看出,反应的Ct值与起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系。通过标准曲线,我们测定CSM-CTD探针对Cronobacter sakazakii标准菌株ATCC 29544纯菌核酸检测的最小拷贝数为131 copies/ul,CSM-CTD探针对Cronobacter malonaticus标准菌株DSM 18702纯菌核酸检测的最小拷贝数为136 copies/ul,CS-CMA探针对Cronobacter sakazakii标准菌株ATCC 29544纯菌核酸检测的最小拷贝数为16 copies/ul。综上,本研究建立的双重荧光定量PCR分种方法可作为克罗诺杆菌属菌株快速、准确、灵敏的分种方法,尤其是可以快速的检测出婴幼儿配方奶粉中是否含有易导致婴幼儿致病的Cronobacter sakazakii,因此,具有较大的应用价值。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R440

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