INPP4B对宫颈癌细胞生长增殖的调控及其在宫颈癌中的表达

发布时间：2017-12-22 08:20

  本文关键词：INPP4B对宫颈癌细胞生长增殖的调控及其在宫颈癌中的表达　出处：《山东大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一。据2012年统计数据显示,全球每年新发宫颈癌病例大约53万,其中约80%的病例在发展中国家。因此在发展中国家宫颈癌已成为女性中仅次于乳腺癌的第二杀手。高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染和两种病毒癌蛋白E6/E7的持续表达是诱导宫颈癌发生的主要因素。然而,在HPV感染人群中只有少数发展为宫颈癌,说明HPV感染是宫颈癌发生的必要但不充分条件。高危型HPV感染促进了细胞向恶性转化的发展,病毒感染后细胞基因的不稳定性导致的突变积累以及细胞内蛋白表达的变化是正常细胞转化为肿瘤细胞的关键步骤。磷脂酰肌醇4-磷酸酶Ⅱ型(INPP4B)是PI3K/AKT通路中的一种磷酸酶,其主要底物是磷脂酰肌醇3,4-二磷酸盐[PI(3,4)P2],INPP4B催化水解[PI(3,4)P2]的4位磷酸基团生成磷脂酰肌醇3-磷酸盐[PI(3)P],降低[PI(3,4)P2]的水平。还有文献报道INPP4B可以直接水解[PI(3,4,5)P3]中的4位磷酸基团,减少[PI(3,4,5)P3]。通过这些反应INPP4B可抑制AKT的活性。已有研究表明,作为PI3K/AKT途径中的负调因子,INPP4B参与调控细胞增殖,细胞迁移,DNA损伤反应等过程。近几年临床与生物学研究佐证了 INPP4B在肿瘤中的复杂作用。在乳腺癌、卵巢癌和黑色素瘤等肿瘤的杂合性缺失谱分析中发现INPP4B的杂合性缺失与患者存活率下降密切相关。在前列腺癌、乳腺癌和黑色素瘤中,INPP4B可通过抑制AKT活性阻碍肿瘤细胞的增殖、侵袭以及小鼠移植瘤的生长。然而,也有研究表明INPP4B在结肠癌、急性白血病(acute myeloid leukemia,AML)以及黑色素瘤中发挥了致癌活性,INPP4B通过激活SGK3(serum-and glucocorticoid-regulated kinase 3,SGK3)途径促进细胞的生长增殖。所以,INPP4B的作用具有肿瘤甚至细胞特异性。迄今为止,INPP4B在宫颈癌中的表达及其对宫颈癌细胞的作用尚未见报道,本研究通过体内外实验探索了 INPP4B对宫颈癌细胞生长增殖、周期和凋亡的影响及其分子机制,并进一步观察分析了INPP4B在临床宫颈癌标本中的表达状况。1.INPP4B抑制宫颈癌细胞的生长增殖目的:研究INPP4B对宫颈癌细胞生长增殖的影响。方法:将INPP4B表达质粒LHCX-INPP4B转染INPP4B表达缺失的HeLa细胞,SiHa细胞以及C33a细胞,通过CCK-8实验,BrdU实验以及克隆形成实验检测上述宫颈癌细胞的生长增殖。同时利用细胞凋亡检测试剂盒检测INPP4B对细胞凋亡的影响。在INPP4B高表达的CaSki细胞中采用INPP4B特异性siRNA干扰其表达,用克隆形成及BrdU实验检测细胞的增殖活性。结果:CCK-8和克隆形成实验显示,过表达INPP4B使宫颈癌细胞活性和克隆形成能力明显下降,BrdU实验表明,转染INPP4B后宫颈癌细胞进入S期的细胞比例减少。特异性siRNA干扰实验结果表明,敲低INPP4B表达促进了 CaSki细胞的生长增殖。但过表达INPP4B对上述宫颈癌细胞的细胞凋亡无明显影响。结论:INPP4B可抑制宫颈癌细胞的生长增殖和细胞周期进程,但对宫颈癌细胞凋亡没有明显促进作用。2.INPP4B表达对宫颈癌细胞中AKT活性的影响目的:观察宫颈癌细胞中INPP4B表达对AKT活性的影响。方法:在HeLa,SiHa和C33a细胞中过表达INPP4B,在CaSki细胞中敲低INPP4B表达,48h后收集细胞蛋白行western blot检测。结果:与对照细胞相比,过表达INPP4B导致HeLa和C33a细胞中pAKT表达含量降低,但敲低INPP4B表达对CaSki细胞中pAKT水平没有明显影响。结论:INPP4B抑制宫颈癌细胞增殖的作用可能部分依赖于其对AKT活性的负调控。3.HPV E6/E7蛋白对宫颈癌细胞INPP4B表达的影响目的:探讨HPVE6/E7转化蛋白对INPP4B表达的影响。方法:选择高表达INPP4B并有HPV16 E6,E7表达背景的CaSki细胞,采用特异性siRNA单独敲低E6表达或同时敲低E6和E7表达,western blot检测有关蛋白的表达。结果:敲低E6、以及E6/E7表达后,CaSki细胞中p53蛋白水平增加,pAKT表达水平明显降低,INPP4B表达轻度降低。结论:HPVE6/E7癌蛋白可促进宫颈癌细胞中pAKT活性增高,并有可能通过PI3K/AKT途径的反馈调节影响INPP4B的表达。4.INPP4B抑制裸鼠体内宫颈癌细胞移植瘤的生长目的:通过体内实验进一步验证INPP4B对宫颈癌细胞生长增殖的抑制作用。方法:利用本室构建的INPP4B稳转宫颈癌细胞株GV367-INPP4BHeLa,注射小鼠皮下建立裸鼠成瘤实验模型。成瘤后进行动物活体成像拍照以及裸鼠移植瘤重量,大小等指标的分析,观察INPP4B过表达对宫颈癌移植瘤生长的影响。结果:与对照GV367-HeLa细胞相比,稳定表达INPP4B蛋白的GV367-INPP4B HeLa细胞在裸鼠体内的生长速度明显缓慢,最终形成肿瘤的大小和重量也明显低于对照组。结论:过表达INPP4B可在体内抑制裸鼠宫颈癌异体移植瘤的生长。5.临床宫颈组织中INPP4B蛋白的表达目的:研究正常宫颈以及宫颈鳞癌组织中INPP4B的表达情况。方法:收取临床正常宫颈以及宫颈鳞状细胞癌组织,real time-PCR以及免疫组化方法检测INPP4B的表达。结果:免疫组化表明,66例宫颈鳞癌组织中,INPP4B阳性率为39.4%,INPP4B缺失率接近60%。在43例正常宫颈鳞状上皮中,INPP4B阳性率为32.5%。统计学分析表明,正常宫颈与宫颈癌组织中INPP4B的表达水平没有显著差异,real time PCR与免疫组化的结果一致。上述结果与Oncomine数据库中的已有数据相符。结论:INPP4B表达在正常宫颈组织与宫颈鳞癌组织中没有明显差异。我们分析正常宫颈组织中INPP4B的表达率较低的原因,可能与正常宫颈细胞中缺少改变细胞生长的刺激因素,使INPP4B表达未被充分诱导有关。综上所述,本研究利用体内外实验探究了 INPP4B对宫颈癌细胞生长增殖的影响,并初步观察了 INPP4B在临床宫颈标本中的表达特点。研究发现:1)过表达INPP4B对宫颈癌细胞生长增殖有抑制作用。2)INPP4B过表达可抑制裸鼠体内宫颈癌细胞移植瘤的生长。3)INPP4B对宫颈癌细胞生长增殖的抑制作用部分依赖于其对于AKT活性的负调控。4)HPVE6/E7癌蛋白可增强宫颈癌细胞中pAKT活性,从而影响INPP4B的表达。本研究为宫颈癌变的分子机制研究提供了新的理论及实验依据,INPP4B有望成为宫颈癌治疗的潜在新靶点,值得进一步深入研究。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.33

【参考文献】

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1 Zhai Lu;Hua Chen;Xiao-Mei Zheng;Man-Ling Chen;;Expression and clinical significance of high risk human papillomavirus and invasive gene in cervical carcinoma[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2017年02期

2 Joycelyn JX Lee;Kiley Loh;Yoon-Sim Yap;;PI3K/Akt/mTOR inhibitors in breast cancer[J];Cancer Biology & Medicine;2015年04期

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本文编号：1319074