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牛磺酸对乙醇诱导大鼠肝细胞损伤的保护作用研究

发布时间:2018-01-02 07:34

  本文关键词:牛磺酸对乙醇诱导大鼠肝细胞损伤的保护作用研究 出处:《沈阳农业大学》2017年硕士论文 论文类型:学位论文


  更多相关文章: 牛磺酸 酒精性肝病 凋亡 防治作用 肝细胞


【摘要】:随着经济的增长,人们饮食习惯的改变,酒精的摄入量逐渐递增,而长期大量的酒精摄入可以引发肝脏损伤,导致酒精性肝病(Alcoholic Liver Disease,ALD)。目前,对于ALD的治疗,医学临床上并没有高效满意的治疗方法。因此,寻找安全、高效的治疗药物是ALD治疗中亟待解决的问题。牛磺酸作为一种天然的游离氨基酸,大量存在于动物体内,具有多种生物学效应,且对机体无毒副作用。本研究通过体外试验,制备乙醇损伤肝细胞模型,检测牛磺酸对乙醇损伤的原代大鼠肝细胞活性、肝细胞功能及肝细胞凋亡的作用,为应用牛磺酸防治酒精导致的肝损伤提供理论依据。试验选取体重为200±20g的雄性Wistar大鼠,采用Seglen原位二步灌注法与机械消化法相结合的方法分离培养出原代大鼠肝细胞,经糖原染色鉴定肝细胞后,使用第3-5代处于对数生长期的肝细胞进行试验。分组如下:正常对照组(C),正常培养:模型组(M),培养基中添加75mmol/L乙醇;牛磺酸干预组(M+T),培养基中添加75mmol/L乙醇和10mmol/L牛磺酸;牛磺酸对照组(T),培养基中添加10mmol/L牛磺酸。培养48 h后,采用MTT法检测细胞抑制率,以及培养基中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、谷氨酰转移酶(GGT)的含量。使用AO-EB染色法检测肝细胞凋亡率,提取肝细胞总RNA及总蛋白,qRT-PCR法及Westerm-blot法检测细胞凋亡相关因子mRNA和蛋白表达量。结果显示:以75mmol/L的乙醇作用48h可使肝细胞损伤达50%,成功诱导原代大鼠肝细胞凋亡模型。对肝细胞抑制率的检测发现,1Ommol/L浓度的牛磺酸能明显减轻乙醇对肝细胞的生长抑制作用。与正常对照组相比,模型组肝细胞培养液中ALT、AST、GGT含量显著升高,牛磺酸干预组较模型组肝细胞培养液中ALT、AST、GGT水平显著下降,说明牛磺酸能有效的减轻乙醇对肝细胞的损伤。通过油红染色观察发现,乙醇能导致脂肪在肝细胞内沉积,而牛磺酸能明显改善肝细胞内脂肪沉积情况。免疫细胞化学染色结果表明,模型组肝细胞凋亡率较对照组显著升高,牛磺酸干预组较模型组极显著降低(0.01)。模型组肝细胞Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-9、Bax的mRNA及蛋白表达水平较对照组有极显著升高(0.01),Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平极显著降低(0.01),牛磺酸干预组Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-9、Bax的mRNA及蛋白表达水平较模型组有极显著降低(0.01),Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平极显著升高(0.01)。本试验结果表明,牛磺酸对乙醇诱导的肝细胞损伤具有保护作用,其机制可能是保护肝细胞膜,减少肝细胞脂肪沉积,并通过调控细胞内源性及外源性凋亡通路而抑制乙醇导致的肝细胞异常调亡。
[Abstract]:Along with the economic growth, people's diet habits change, the alcohol intake gradually increases, and the long-term large amount of alcohol intake can lead to liver damage. There is no effective and satisfactory medical treatment for the treatment of ALD, which results in Alcoholic Liver Disease1. Therefore, there are no effective and satisfactory methods for the treatment of ALD. It is an urgent problem to find safe and effective therapeutic drugs in the treatment of ALD. Taurine, as a kind of natural free amino acid, is abundant in animals and has a variety of biological effects. In this study, ethanol induced hepatocyte injury model was established in vitro to detect the hepatocyte activity, hepatocyte function and hepatocyte apoptosis of rats with ethanol injury. In order to provide theoretical basis for taurine to prevent and cure liver injury induced by alcohol, male Wistar rats weighing 200 卤20g were selected. Primary rat hepatocytes were isolated and cultured by Seglen in situ two-step perfusion method and mechanical digestion method. The hepatocytes were identified by glycogen staining. The experiment was carried out by using the hepatocytes in the logarithmic growth phase of passage 3-5. The cells were divided as follows: normal control group, normal culture group: model group, 75 mmol / L ethanol was added to the culture medium; In taurine intervention group, 75 mmol / L ethanol and 10 mmol / L taurine were added to the medium. Taurine was added to the culture medium with 10 mmol / L taurine. After 48 hours of culture, the inhibition rate of cells was detected by MTT assay, and the alanine aminotransferase (alt) in the medium was measured. AO-EB staining method was used to detect the apoptosis rate of hepatocytes and extract the total RNA and total protein of hepatocytes. The expression of apoptosis-related factor mRNA and protein was detected by qRT-PCR and Westerm-blot. The results showed that:. Exposure to 75 mmol / L ethanol for 48 hours resulted in 50% damage to hepatocytes. The primary rat hepatocyte apoptosis model was successfully induced. 1the concentration of ommol / L taurine significantly alleviated the inhibitory effect of ethanol on the growth of hepatocytes. Compared with the normal control group, the GGT content in the hepatocyte culture medium of the model group was significantly higher than that of the control group. Compared with the model group, the level of alt ASTT GGT in the cultured medium of taurine intervention group was significantly lower than that in the model group, which indicated that taurine could effectively reduce the damage of ethanol to hepatocytes, and it was found by oil red staining. Ethanol could induce fat deposition in hepatocytes, while taurine could significantly improve lipid deposition in hepatocytes. The results of immunocytochemical staining showed that the apoptosis rate of hepatocytes in the model group was significantly higher than that in the control group. Compared with the model group, the taurine intervention group significantly decreased the level of caspase-3 and caspase-9 in the hepatocytes of the model group. The expression level of mRNA and protein in Bax was significantly higher than that in control group. The expression of Bcl-2 mRNA and protein in Bax was significantly lower than that in control group (P < 0.01). The expression level of mRNA and protein of Fas-FasL- Caspase-3, Caspase-9 and Bax in taurine intervention group was significantly lower than that in model group (P < 0.01). The expression level of Bcl-2 mRNA and protein increased significantly. The results showed that taurine had a protective effect on ethanol-induced hepatocyte injury. The mechanism may be to protect the liver cell membrane, reduce the fat deposition of the liver cell, and inhibit the abnormal apoptosis induced by ethanol by regulating the endogenous and exogenous apoptosis pathway.
【学位授予单位】:沈阳农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R575

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本文编号:1368290

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