活血化瘀中药有效成分对高糖诱导的大鼠胃平滑肌细胞自噬相关蛋白及JNK信号通路的影响

发布时间：2018-01-05 03:05

  本文关键词：活血化瘀中药有效成分对高糖诱导的大鼠胃平滑肌细胞自噬相关蛋白及JNK信号通路的影响　出处：《河北医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的:糖尿病胃轻瘫(DGP)是以胃排空延迟为主要特点的症候群。主要以上腹烧灼感、腹痛、恶心、呕吐、餐后饱胀及早饱感为表现。糖尿病胃轻瘫这一名词在1958年首次被Ksaaander提出。随着经济的发展、人民生活水平的提高及饮食结构的变化,这种并发症在全球范围内逐年递增,据统计,在Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病患者中超过50%为DGP[1-2],严重影响患者的生活质量及预后。目前国内外研究表明DGP的发病机制主要为高血糖、自主神经功能障碍、胃肠激素分泌异常、平滑肌损害、微血管病变、Cajal间质细胞(ICC)缺失以及代谢紊乱等。胃平滑肌细胞是胃肠运动最终的执行者,DGP的发病机制中胃平滑肌损伤是胃动力异常的最终环节。在一些超微结构研究中可见DGP大鼠胃窦平滑肌细胞排列紊乱,且平滑肌细胞胞质大量溶解,在胃电活动的研究中可见DGP大鼠胃平滑肌的收缩频率及振幅下降,由于胃的舒缩功能与胃的机械运动关系密切,这就导致了胃松弛性增加[3]。目前自噬在糖尿病并发症中的研究较多,自噬即自我吞噬,它是广泛存在于真核细胞中的一种细胞内代谢降解的生命现象。自噬溶酶体是自噬的后期阶段,它标志着自噬的存在。自噬是一把双刃剑,在生理状态下,自噬可以清除胞内功能损伤及衰老的细胞器,维持主要的合成代谢。但是,如果过度激活自噬则可以引起细胞内大量必要分子和细胞器被分解,从而导致细胞出现Ⅱ型程序性死亡。Beclin1及LC3是参与自噬的重要蛋白,Beclin1构成了自噬的启动蛋白,LC3是自噬溶酶体膜的延伸的标志性蛋白质。JNK信号通路是介导自噬的一条重要通路,JNK信号通路主要是通过使Bcl-a家族蛋白磷酸化进而上调自噬基因Beclin-1来促进自噬发生。在糖尿病胰岛素抵抗的研究中发现抑制JNK通路可下调自噬,进而改善糖尿病胰岛素抵抗[4-5]。在STZ诱导的糖尿病大鼠胃组织中可检测到高表达的自噬蛋白,因此自噬的功能异常在DGP的发生、发展上起着重要的作用。但在高糖诱导的离体胃平滑肌细胞(GSMC)中是否存在过度自噬,是否与JNK信号通路有关,尚未知。在临床及动物实验中由丹参、川芎、水蛭组成的活血化瘀中药复方治疗DGP上取得了良好的疗效,之前的研究显示活血化瘀通络中药可以通过促进ICC活动、调节胃肠激素分泌及修复胃血管内皮等作用改善DGP胃排空障碍。但活血化瘀通络中药的治疗机制没有完全明确,本实验采用活血化瘀组方的有效成分,即丹参酮Ⅱ-A(TSN),川芎嗪(TMP)、水蛭素(Hirudin)共同干预由高糖诱导的大鼠胃平滑肌细胞,观察其对GSMC自噬蛋白及其JNK通路表达的影响,研究活血化瘀中药有效成分对平滑肌细胞收缩力的影响,以探讨活血化瘀通络中药组方有效成分对DGP可能的作用机制。方法:1将大鼠胃平滑肌细胞随机分为空白对照组、高糖组、川芎嗪浓度梯度组、丹参酮Ⅱ-A浓度梯度组、水蛭素浓度梯度组,用MTT法检测丹参酮Ⅱ-A,川芎嗪、水蛭素的最适药物浓度。2实验分为正常对照组(25mmol/l葡萄糖)、高糖组(40mmol/l葡萄糖)、中药组(40mmol/l葡萄糖加中药有效成分共孵育)、JNK抑制剂组(40mmol/l葡萄糖加20μmol/L SP600125共孵育),各个组分别给予药物处理24小时。3各组应用丫啶橙染色荧光显微镜观察细胞内自噬溶酶体。4各组细胞戊二醛固定后应在倒置显微镜下用显微尺测量细胞长轴长度,进而测定细胞收缩力。5采用Western blot方法检测LC3-Ⅱ、Beclin-1、JNK、P-JNK蛋白的表达情况。结果:1活血化瘀中药组方有效成分对细胞收缩力的影响:测量各组大鼠平均细胞长度,与正常对照(47.13±8.98μm)组比较,高糖组(62.63±4.44μm)大鼠GSMC明显舒张,GSMC的平均长度显著增加,具有统计学意义(P0.05),中药组(51.21±6.99μm)及JNK抑制剂(49.79±6.18μm)组均无统计学差异(P0.05)。与高糖组比较,中药组大鼠GSMC有较明显的收缩,有统计学差异(P0.05),JNK抑制剂组(49.79±6.18μm)大鼠GSMC明显的收缩,有统计学差异(P0.05)。与JNK抑制剂组比较,中药组无统计学差异(P0.05)。提示活血化瘀中药组方有效成分可以促进胃平滑肌细胞收缩,可能通过抑制JNK通路发挥作用。2活血化瘀中药组方有效成分对GSMC自噬溶酶体的影响:倒置显微镜下可见正常组细胞呈绿色荧光,与正常对照组相比,高糖组GSMC胞质中亮桔红色点状荧光明显增加。与高糖组相比,中药组亮桔红色点状荧光减少,JNK抑制剂组,红色荧光也明显减少。提示高糖可以诱导GSMC过度自噬,而活血化瘀中药组方有效成分可以抑制自噬溶酶体的生成,下调高糖造成的细胞过度自噬从而减少细胞损伤,保证细胞正常的舒缩功能。这可能为其治疗DGP胃动力障碍的机制之一。3活血化瘀中药组方有效成分对高糖诱导的GSMC细胞Beclin1和LC3蛋白及JNK磷酸化的影响:结果显示:与正常对照组比较,经高糖处理后LC3-Ⅱ、Beclin-1、JNK、p-JNK蛋白表达显著增加(P0.05),与高糖组比较,中药组及JNK抑制剂组LC3-Ⅱ、Beclin-1、JNK、p-JNK蛋白表达显著减轻(P0.05),而正常对照组、中药组及JNK抑制剂组无统计学差异(P0.05)。提示高糖上调自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1及JNK相关蛋白JNK、p-JNK,诱导自噬过度增加,可能是通过激活JNK信号通路诱导GSMC的自噬。而活血化瘀中药组方有效成分抑制JNK通路下调细胞过度自噬从而减少细胞损伤,这可能为其治疗DGP胃动力障碍的机制之一。结论:1采用组织贴块法,经免疫组化鉴定,成功获得大鼠GSMC。2高糖培养的GSMC存在细胞收缩力下降,高糖可能通过激活JNK信号通路诱导GSMC的自噬。3活血化瘀中药组方有效成可明显改善GSMC收缩力,可能与其通过下调LC3-Ⅱ、Beclin-1自噬蛋白及JNK、p-JNK通路蛋白表达而抑制GSMC过度自噬有关。此可能为活血化瘀中药组方有效成治疗DGP的机制之一。
[Abstract]:Objective : To study the effect of DGP on gastric smooth muscle cells in patients with type 鈪，

本文编号：1381266