氧化低密度脂蛋白刺激下的巨噬细胞中YY1和STAT1对microRNA-29a的转录调控作用

发布时间：2018-01-05 03:17

本文关键词：氧化低密度脂蛋白刺激下的巨噬细胞中YY1和STAT1对microRNA-29a的转录调控作用　出处：《浙江大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：研究背景及目标:以动脉粥样硬化为病理基础的冠状动脉粥样硬化性心脏病及其并发症如血栓栓塞,乳头肌功能失调和心脏破裂对全世界人类健康造成了严重的威胁,然而其发病机制至今尚未完全阐明。在动脉粥样斑块的形成过程中涉及多种细胞的参与,如血管内皮细胞,血管平滑肌细胞和单核巨噬细胞等。其中,单核细胞在血液中可以分化成为巨噬细胞,而巨噬细胞在ox-LDL的刺激下可以摄取脂质,分泌炎性细胞因子或与其他细胞相互作用,在多种因素相互作用下最终导致动脉粥样斑块的形成。已有大量文献报道miRNAs参与包括冠心病在内的多种心血管疾病的病理生理过程,研究结果表明在miRNAs调控下单核巨噬细胞功能的改变也是冠心病发病过程中的重要环节。MiR-29a参与炎症免疫,糖代谢及细胞外基质形成等多种生理过程。近期研究发现miR-29a可调控巨噬细胞内与凋亡及蛋白质转运相关的基因表达从而影响肿瘤的发生。而我们之前研究也发现在ox-LDL刺激树突状细胞后,miR-29a不仅表达增加,还可引起清道夫受体SRA及CD36表达上调。然而,miR-29a在ox-LDL刺激后的巨噬细胞中的效应及作用机制仍未知。故本研究目的主要在于探索miR-29a在ox-LDL刺激下的巨噬细胞中表达的变化,及其对巨噬细胞功能的影响和相关作用机制。研究方法:本实验采用PMA处理后THP-1细胞分化成的巨噬细胞作为开展本研究的主要细胞。经过ox-LDL刺激后,检测miR-29a的表达情况。通过转染siRNA对ox-LDL摄取过程中主要参与因素如清道夫受体SRA,LOX-1和CD36的表达量改变,观察miR-29a的表达情况,以及下调miR-29a表达水平后观察清道夫受体的表达。其次,通过双荧光素酶报告检测以及转录因子滤板法测定等方法确定参与miR-29a表达的转录因子。通过生物信息学分析,DNA琼脂糖凝胶电泳,CHIP,细胞免疫共沉淀等研究转录因子调控miR-29转录的机制。此外,我们还通过过表达miR-29a观察巨噬细胞分泌的炎性细胞因子以及脂质摄取的情况。结果:将THP-1成功分化巨噬细胞后,给予ox-LDL刺激后,观察发现miR-29a的表达上升。抑制SRA和LOX-1,miR-29a的表达降低,而抑制CD36后miR-29a的表达水平没有明显变化。miR-29a可以促进上调SRA的表达,而抑制miR-29a后,SRA表达下降。通过双荧光素酶报告检测以及转录因子滤板法测定发现巨噬细胞内miR-29a转录起始位点上游2000bp的区域在经过ox-LDL刺激后活性增强,而YY1和STAT1是与该区域结合的主要转录因子。分别抑制YY1和STAT1后发现miR-29a表达下降。生物信息学分析后发现miR-29a的启动子区域仅有YY1的结合位点,而无STAT1的结合位点,通过DNA凝胶电泳后证实YY1可与野生型的miR-29a结合,而与突变型不能结合。通过CHIP发现ox-LDL刺激后YY1与STAT1与启动子结合增加,此外YY1和STAT1表达增加。通过免疫共沉淀显示YY1和STAT1可相互结合并在细胞核内定位增加。抑制JAK1/2激酶后,YY1和STAT1的表达下降且miR-29表达也下调。过表达mir-29a不仅引起炎性细胞因子IL-1β,IL-6和TNF-α的分泌增多,而且促进巨噬细胞脂质摄入,而抑制miR-29a后使IL-6和TNF-α的分泌及脂质摄取减少。结论:ox-LDL刺激巨噬细胞后引起转录因子YY1及STAT1表达升高,通过YY1与STAT1结合后再与miR-29a的启动子区域结合,从而促进miR-29a的转录,激活JAK1/2激酶也可与YY1与STAT1协同诱导miR-29a表达。此外,我们还发现mir-29a可正性调控炎性细胞因子分泌以及脂质摄取增加。
[Abstract]:Objective : To investigate the expression of miR - 29a in the pathogenesis of coronary heart disease ( CHD ) induced by ox - LDL . The results show that miR - 29a can regulate the expression of miR - 29a in the course of the formation of ox - LDL . The results show that miR - 29a can regulate the expression of miR - 29a in the process of ox - LDL stimulation . In order to promote the transcription of miR - 29a , the expression of miR - 29a can also be induced in combination with YY1 and STAT1 . In addition , we find that mir - 29a can regulate inflammatory cytokine secretion and increase lipid intake .

【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R541.4

【参考文献】