人降钙素原的原核表达及不同介质下稳定性研究

发布时间：2018-01-08 23:08

  本文关键词：人降钙素原的原核表达及不同介质下稳定性研究　出处：《江苏大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的:体外原核表达人降钙素原(Procalcitonin,PCT)基因,获取高纯度PCT重组蛋白;优化PCT重组蛋白表达条件;制备鼠源性多克隆抗体;分析临床PCT检测的主要影响因素并探讨PCT重组蛋白最佳储存介质。方法:根据NCBI上人降钙素原的基因序列,利用Primer Premier 5.0设计引物,PCR技术扩增全长序列,经DNA胶回收、质粒提取、基因连接和酶切鉴定等步骤,构建原核表达重组载体PCT/p ET-22b(+)。将该重组质粒转化至E.coli BL21并诱导表达,观察诱导剂浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)、诱导时间(4h、8h、12h、16h、20h)、诱导温度(22℃、27℃、32℃、37℃)及转速(80、120、160、200、250 r/min)等对蛋白表达的影响。采用镍柱亲和层析法纯化PCT重组蛋白,并用Western blotting和胶体金法对其鉴定。纯化的PCT重组蛋白与等体积佐剂充分研磨乳化后,免疫Balb/c小鼠,第三次免疫7天后采集血液并分离血清,用ELISA法检测血清抗体效价。分析血液标本类型、保存时间和温度对PCT检测的影响;以生理盐水、小牛血清和PBS稀释PCT重组蛋白,分别检测保存5d、10d、20d、30d的PCT浓度变化,并进行统计学分析。结果:琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR扩增产物约350 bp。同源性比对分析说明PCT基因片段(348 bp)成功插入p TG19-T载体,未出现碱基突变。用Bam H I和HindⅢ对重组表达载体PCT/p ET-22b(+)酶切,得到约350 bp和5 500 bp片段。超声波破碎菌体后,SDS-PAGE电泳显示PCT重组蛋白以可溶性形式存在,Mr约14KD,经镍柱亲和层析法纯化后即可获得。Western blotting和PCT胶体金法结果呈阳性,显示重组蛋白含组氨酸标签(His-tag),并能与PCT抗体反应。对不同表达条件下的产物进行SDS-PAGE电泳,结果显示:诱导时间12~20h、诱导剂终浓度为0.2~1.0 mmol/L、诱导温度为22℃、转速为80~160r/min时,上清液中PCT蛋白表达量较高。用PCT重组蛋白免疫Balb/c小鼠,第三次免疫7天后血清抗体效价均1:512 000。血液标本在保存过程中,PCT会出现下降。25℃下血浆管放置4h(下降4.1%)和全血管放置2h(下降5.4%),在4℃下血浆管放置4h和全血管放置2h后,PCT检测值之间的差异具有统计学意义(P0.05)。在小牛血清中PCT重组蛋白4℃可保存20d,结果不变,显著优于生理盐水和PBS。结论:成功构建PCT/p TG19-T重组克隆载体和PCT/p ET-22b(+)重组表达载体,PCT重组蛋白以可溶性形式存在,经镍柱亲和层析法纯化后即可获得。最佳诱导表达条件:22℃、IPTG浓度0.2 mmol/L、12h和160 r/min。PCT重组蛋白具有很强的免疫原性,易获得高效价PCT鼠源性多克隆抗体。PCT检测血液标本保存不要超过4h,最好在2h内检测,小牛血清是储存PCT重组蛋白的首选介质。
[Abstract]:Objective: to express human procalcitonin PCT gene in vitro and obtain high purity PCT recombinant protein. The expression conditions of PCT recombinant protein were optimized. Preparation of murine polyclonal antibody; The main influencing factors of clinical PCT detection and the optimal storage medium of PCT recombinant protein were analyzed. Methods: according to the gene sequence of human procalcitonin on NCBI. The full-length sequence was amplified by Primer Premier 5.0 primer and amplified by DNA gel recovery, plasmid extraction, gene linkage and restriction endonuclease identification. A prokaryotic expression vector PCT/p ET-22b was constructed. The recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21 and induced to express. The induction time was 4 h ~ (8) h ~ (12) h ~ (12) ~ (16) h ~ (-1) ~ 20 h ~ (-1), and the induction temperature was 22 鈩，

本文编号：1399026