应用基因芯片技术探索Nrf2介导的乳腺癌阿霉素耐药机制初步研究

发布时间：2018-02-08 14:25

本文关键词： 乳腺癌 Nrf2 阿霉素耐药　出处：《广西医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景化疗是乳腺癌治疗方案的重要组成部分,能够杀伤或控制体内微小肿瘤病灶。乳腺癌对化疗药物产生耐药性是患者肿瘤复发或远处转移,导致治疗失败的主要原因。目前含阿霉素类的化疗方案使用广泛,成为乳腺癌患者术后辅助化疗一线药物。但临床上阿霉素类的耐药现象发生率相当高。据研究报道,Nrf2信号通路与肿瘤耐药相关,而Nrf2与乳腺癌阿霉素耐药的相关研究较少。因此对Nrf2与乳腺癌阿霉素耐药的相关性进行深入研究非常必要。目的通过Nrf2-siRNA稳定转染人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF7/ADR,初步研究Nrf2对乳腺癌细胞生物学特性(增殖、凋亡)的影响,并探索Nrf2的表达水平与乳腺癌阿霉素耐药相关性;应用基因芯片技术检测经Nrf2-siRNA稳定转染的MCF-7/ADR细胞株与对照组MCF-7/ADR细胞株之间的基因表达谱差异,筛选耐药相关基因,探讨与乳腺癌耐药相关的Nrf2潜在下游基因。本研究促进对乳腺癌耐药机制的了解,在增加乳腺癌化疗敏感性及提高乳腺癌化疗疗效方面,有较大意义。方法本研究选择MCF-7/ADR细胞株作为研究对象,经Nrf2-RNAi成功稳定转染MCF7/ADR细胞株,沉默Nrf2目的基因表达。通过荧光显微镜下观察4计算转染效率并应用Real time PCR检测siRNA对Nrf2 mRNA的干扰效率。成功转染后通过表柔比星(表阿霉素)药物实验、MTT法检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞凋亡;基因芯片检测经Nrf2-siRNA成功转染后的MCF-7/ADR细胞株与对照组细胞株基因表达谱的差异,筛选出基因差异倍数(|FC|)1.5倍的差异基因,结合生物信息学及基因差异的显著性,筛选出与乳腺癌细胞耐药相关的基因。并初步探讨差异基因在pathway信号通路的富集及GO分析(Gene Ontology Analysis)。结果1、慢病毒成功转染目的细胞MCF-7/ADR细胞,经过稳定传代后,以RT-PCR检测干扰组与对照组Nrf2 mRNA相对表达量,结果发现,相对于阴性对照组,干扰组中Nrf2基因敲减效率达到54.3%,符合表达谱芯片实验的要求(p0.05);2、表柔比星作用稳定转染Nrf2-shRNA的MCF-7/ADR细胞(KD)及对照组细胞株(NC)后,MTT法检测发现Nrf2-shRNA转染的MCF-7/ADR细胞较对比组细胞在多个表柔比星药物浓度中增殖较为缓慢,差异有统计学意义。3、接着以流式细胞仪检测两株细胞的凋亡率,结果发现乳腺癌耐药细胞株转染Nrf2-siRNA后,对表柔比星的耐药性发生逆转,对表柔比星更敏感,转染Nrf2-siRNA后的细胞株凋亡率更高(P0.05)4、通过基因芯片检测成功敲除目的基因(稳定转染Nrf2-shRNA)前后MCF-7/ADR细胞株差异表达基因,共筛选出具有差异倍数(|FC|)1.5的基因878个,涉及多种分子功能,参与多个生物学过程。其中表达上调的基因341个,表达下调的基因537个。结合生物信息学及基因差异显著性,筛选出与乳腺癌细胞耐药相关的关键基因,下调的基因主要包括RAC1、ASNS、NRP1以及SNAI2等,上调的基因主要为PHLPP2等。结论1.本研究结果表明,通过沉默Nrf2基因表达,可提高乳腺癌阿霉素耐药细胞株对阿霉素的敏感性(P0.05),证实了Nrf2与乳腺癌阿霉素耐药性相关。2.乳腺癌耐药是一个及其复杂的过程,通过基因芯片技术并结合生物信息学方法筛选出具有显著差异性的基因,其中差异较显著的有RAC1、ASNS、NRP1、SNAI2及PHLPP2等,为Nrf2下游基因的研究提供方向。
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【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.9

【参考文献】