超氧化物歧化酶的季铵化壳聚糖修饰及其抗结肠炎作用研究

发布时间：2018-02-10 02:45

本文关键词： 超氧化物歧化酶壳聚糖衍生物(O-HTCC) 结合物长期稳定性炎症性肠病活性氧自由基巨噬细胞　出处：《山东大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)主要指 HO·、O2·-和 H2O2 等,是正常氧代谢的副产物,在细胞的增殖与分化中有举重若轻的地位。然而,过量的ROS可引发氧化应激(oxidative stress)反应,最终可能导致一系列严重的疾病。其中,炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)作为临床常见的肠道疾病,具有复发性。尽管该病的病因仍然不能完全确定,但其严重程度与体内ROS的水平密切相关。因此,清除体内积累的过多的ROS被认有是缓解IBD的可行策略。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是机体抗氧化体系的关键酶,将胞内超氧阴离子歧化为氧和水是其参与的重要反应。因此,外源SOD酶被认为是治疗ROS相关疾病的潜在治疗剂。针对SOD稳定性差、半衰期短及难以进入细胞的缺点,本课题拟在前期研究的基础上,采用水溶性好的6-0-季铵化壳聚糖衍生物——6-0-2'-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(6-0-2-hydroxylpropyltrimethyl ammonium chloride chitosan,O-HTCC)对 SOD 的末端羧基进行结构修饰,纯化得到O-HTCC-SOD结合物。通过测定酶活的变化比较了结合物与天然SOD在室温下长期储存时的稳定性差异。利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导建立小鼠巨噬细胞炎症模型,ELISA试剂盒测定结合物对细胞炎症因子分泌的影响,荧光探针DCFH-DA测定结合物对细胞内ROS水平的影响。最后,利用葡聚糖硫酸钠(dextransulfatesodium,DSS)建立小鼠急性结肠炎实验模型,深入探讨了结合物对急性结肠炎的治疗效果。本学位论文取得的主成果如下:1.O-HTCC-SOD的制备及性质分析通过三步化学反应将含季铵基团的2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)连接到壳聚糖C6位的羟基上,纯化得到水溶性良好的6-0-季铵化壳聚糖衍生物(命名为O-HTCC),产率达到81.2%,IR和1HNMR确定了结构的正确性。使用茚三酮比色法测定自由氨基含量,得到的O-HTCC的自由氨基率高达71.5%。SOD的末端羧基经碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)活化后,与O-HTCC的自由氨基形成酰胺键得到修饰产物O-HTCC-SOD,修饰率超过70%。经弱阴离交换柱层析纯化得到结合物精品。纯化组分通过SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳验证,分析表明修饰产物的分子量明显增大,且为连续分布的多组分。连续测定初始酶活相同的天然SOD与O-HTCC-SOD在室温下的酶活保留率,结果表明,室温下存放30 d后结合物的酶活保留率高达86.8%,而SOD仅为44.1%。因此,O-HTCC-SOD在室温条件下的长期稳定性显著高于未修饰的SOD,有利于SOD酶的长期储存。2.O-HTCC-SOD的体外抗炎作用评价淀粉肉汤法收集得到小鼠腹腔巨噬细胞,MTT比色法测定O-HTCC-SOD对细胞的毒性,结果表明:在剂量范围为10U/mL～1250 U/mL时,O-HTCC-SOD与SOD均未表现明显的细胞毒性。利用LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞,建立体外炎症模型。通过ELISA试剂盒测定,发现O-HTCC-SOD与SOD均能够显著抑制LPS诱导的细胞炎症因子,如TNF-α、IL-6、IL-1β的产生,但未表现出明显的剂量依赖性,提示其作用源于SOD酶的催化活性。巨噬细胞经O-HTCC-SOD或天然SOD预处理后,与LPS共同孵育6 h,,然后装载荧光探针DCFH-DA,测定细胞内的ROS水平,结果表明:O-HTCC-SOD预处理的细胞的ROS水平显著低于模型组(P0.01);SOD组的ROS水平则未有显著下降(P0.05)。这一结果表明,O-HTCC修饰的SOD入胞能力增强,从而提高了 SOD的清除胞内ROS的能力。3.O-HTCC-SOD对DSS诱导的小鼠结肠炎的防护作用评价通过使BALB/c小鼠口服5%葡聚糖硫酸钠(DSS)建立急性结肠炎模型,尾静脉注射不同剂量的O-HTCC-SOD,深入研究其抗炎作用,并比较O-HTCC-SOD、未修饰的SOD、O-HTCC与SOD的混合物的治疗效果的差异。结果显示:连续5天自由饮用5%的DSS可使小鼠表现出典型的急性结肠炎症状,包括体重明显下降,疾病活动指数(disease activity index,DAI)显著升高,结肠长度大大缩短,结肠组织的髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)水平显著升高。并且,结肠病理切片观察发现明显的结肠部位损伤,例如上皮和杯状细胞损失、隐窝病变和大面积的炎性细胞浸润。与模型组相比,O-HTCC-SOD显著抑制了 DSS导致的体重下降、DAI升高、结肠长度缩短及MPO活性升高(P0.01),并大大减轻DSS诱导的结肠病理学损伤。相比之下,天然SOD及其与O-HTCC的混合物除能在一定程度上抑制DAI和MPO活性升高(P0.05)外,对结肠长度缩短、病理学改变等症状未能表现出明显改善(P0.05)。因此,与天然SOD相比,经O-HTCC修饰得到的O-HTCC-SOD治疗DSS诱导的结肠炎的效果显著增强。此外,O-HTCC-SOD对结肠炎的体内量效关系研究表明:不同剂量(1.5 kU/kg～6.0 kU/kg)结合物均能显著抑制DSS导致的DAI升高(P0.05),但未呈明显的剂量依赖性;剂量为3.0kU/kg时对结肠缩短抑制作用最佳;剂量为3.0～4.5 kU/kg时,对MPO水平抑制作用最佳。总之,O-HTCC-SOD在剂量为3.0 kU/kg时,对DSS诱导的急性结肠炎具有最佳的治疗效果。4.O-HTCC-SOD的免疫原性本文选用以SOD和O-HTCC-SOD为免疫原对BALB/c小鼠进行免疫。第一次免疫两周后,进行第二次免疫,再隔两周,摘眼球取血得到血清,用间接ELISA法检测各组小鼠血清中的IgG水平。O-HTCC-SOD的免疫效价明显较未修饰的SOD低。综上所述,SOD经壳聚糖的衍生物O-HTCC修饰,得到的结合物O-HTCC-SOD在室温下长期保存时,稳定性显著提高;O-HTCC-SOD能显著抑制LPS诱导的促炎症因子和胞内ROS释放;O-HTCC-SOD对DSS诱导的急性结肠炎有明显的缓解作用,是一种具有研究和开发价值的新型抗结肠炎候选药物。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R943;R96

【参考文献】