hIgD对B淋巴瘤细胞功能的影响及hIgD-Fc-Ig融合蛋白的作用

发布时间：2018-02-27 14:15

  本文关键词： B细胞淋巴瘤 B细胞受体 免疫球蛋白D 免疫球蛋白D受体 融合蛋白hIgD-Fc-Ig　出处：《安徽医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：淋巴瘤(lymphoma)起源于淋巴结和淋巴组织,是免疫系统的恶性肿瘤。淋巴瘤按照细胞起源分为:B细胞淋巴瘤、T细胞和NK细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤。淋巴瘤具有高度异质性,故治疗上也差别很大,目前淋巴瘤的临床治疗仍是以联合化疗为主,但因其毒副作用及耐药性限制了临床使用。因此,开发新的有效治疗药物,提高淋巴瘤的治疗效果已经成为研究热点。随着CD20单克隆抗体美罗华的问世,开创了肿瘤靶向治疗的先河,越来越多的B细胞淋巴瘤治疗新靶点被发现。其中BCR(B cell receptor)和BTK(Brutons tyrosine kinase)激酶抑制剂伊鲁替尼Ibrutinb在B细胞淋巴瘤的治疗中已经取得了突破性成果。BCR复合物及其介导的下游信号途径在正常B细胞及多种肿瘤B细胞中发挥着至关重要的作用,调控其途径关键分子的活性可以选择性地促进或抑制特定B细胞扩增。BCR分为Ig M(Immunoglobulin M)类型BCR和Ig D(Immunoglobulin D)类型BCR,其中m Ig D(Membrane Ig D)介导的信号通路包括在BCR信号通路之中。免疫球蛋白D(Ig D)包括s Ig D(Secreted Ig D)和m Ig D,在抗原识别、B淋巴细胞活化以及免疫反应调节上发挥重要作用。临床发现,Ig D型骨髓瘤患者s Ig D明显升高,感染性疾病和自身免疫病患者血液中s Ig D水平也较高,包括类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)等。本课题组前期研究发现s Ig D在弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)患者血清中表达较健康志愿者明显升高;h Ig D蛋白可以上调Burkitt淋巴瘤细胞Daudi表面IgDR的表达,可以显著地促进Daudi细胞的增殖,减少细胞凋亡,加速细胞周期从G1期到S期的转化进程。结果提示Ig D-IgDR通路有可能成为治疗B细胞恶性增殖相关疾病的新靶点,阻断Ig D-IgDR之间的相互作用可能成为B细胞淋巴瘤免疫新疗法。课题组以IgDR为靶点成功将h IgD-Fc与h IgG-Fc融合并构建了融合蛋白h Ig D-Fc-Ig(已申请专利),旨在特异性阻断Ig D-IgDR通路。本课题以B淋巴瘤细胞为研究对象,观察IgDR在Daudi和Ramos细胞上的表达情况并比较h Ig D、h Ig D-Fc、h Ig D-Fc-Ig在Daudi和Ramos细胞上与IgDR结合的亲和力大小,检测h Ig D对Daudi和Ramos细胞的增殖、凋亡、周期的作用及h Ig D-Fc-Ig融合蛋白对h Ig D上述作用的影响,并进行了部分机制的研究,探讨Ig D及IgDR在B细胞淋巴瘤发病中发挥的作用,为h Ig D-Fc-Ig成为治疗B细胞淋巴瘤的创新药物提供可能的理论和实验依据。目的:观察IgDR在Daudi和Ramos细胞上表达情况,比较h Ig D、h Ig D-Fc和h Ig D-Fc-Ig在Daudi和Ramos细胞上与IgDR结合的亲和力大小,检测h Ig D对Daudi和Ramos细胞的增殖、凋亡、周期的作用及h Ig D-Fc-Ig融合蛋白对h Ig D上述作用的影响,并研究部分机制,探讨Ig D及IgDR在B淋巴瘤细胞中所起的作用以及为h Ig D-Fc-Ig成为治疗B细胞淋巴瘤的创新药物提供可能的理论和实验依据。方法:体外培养Daudi和Ramos细胞,使用不同浓度的h Ig D和h Ig D-Fc-Ig处理细胞后,采用CCK-8法检测细胞增殖活性;台盼蓝染色检测细胞活力;流式细胞术(FCM)检测Daudi及Ramos细胞上IgDR的表达情况,h Ig D、h Ig D-Fc和h Ig D-Fc-Ig与IgDR结合的亲和力大小以及细胞周期变化及细胞凋亡率;Western blot法检测不同处理方式下Daudi和Ramos细胞c-myc、cyclin D3、CDK6、p16~(INK4a)蛋白的表达情况。结果:1.IgDR在淋巴瘤细胞中的表达情况及h Ig D、h Ig D-Fc和h Ig D-Fc-Ig与IgDR的亲和力检测。使用本课题组建立的流式细胞术检测IgDR表达的方法,发现Daudi和Ramos细胞上均有IgDR的表达。使用本课题组建立的非放射性荧光标记的配体受体结合实验方法,检测h Ig D、h Ig D-Fc及h Ig D-Fc-Ig与Daudi细胞上IgDR结合的Scatchard直线方程分别是Y=-0.567X+2072.8(r2=0.8796),Y=-3140.2X+107(r2=0.6792),Y=-901.53X+2×106(r2=0.9097);得出解离常数K_D和受体最大结合容量B_(max)分别是9.6×10-9M和3656 arbitrary unit/104 cells、1.27×10-11M和3184arbitrary unit/104 cells、2.21×10-11M和2219 arbitrary unit/104 cells。流式细胞术检测Ig D、Ig D-Fc及Ig D-Fc-Ig与Ramos细胞上IgDR结合的Scatchard直线方程分别是Y=-0.1583X+194.43(r 2=0.6165),Y=-1146.6X+1011(r 2=0.7047),Y=-6.7507X+6×108(r 2=0.8074);得出解离常数K_D和受体最大结合容量B_(max)分别是3.4×10-8M和1228 arbitrary unit/104 cells、3.48×10-11M和8.7×107arbitrary unit/104 cells、2.96×10-9M和8.9×107 arbitrary unit/104 cells。2.h Ig D对淋巴瘤细胞Daudi和Ramos的增殖、凋亡和周期的作用及h Ig D-Fc-Ig融合蛋白对h Ig D上述作用的影响。体外培养并选取对数生长期的Daudi及Ramos细胞,用不同浓度的h Ig D(1,3,10μg/ml)刺激不同时间(12,24,36,48,72 h),观察细胞活力和增殖情况。结果表明:与对照组相比,h Ig D明显促进Daudi、Ramos细胞的活力和增殖。用h Ig D(3μg/ml)和不同浓度的h Ig D-Fc-Ig(0,0.3,1,3,10,30,100μg/ml)同时作用于细胞,培养不同时间(12,24,36,48,72 h),结果表明:h Ig D-Fc-Ig抑制了h Ig D的促增殖作用;Annexin-V/PI流式检测结果显示h Ig D(3μg/ml)降低了Daudi和Ramos细胞的凋亡率,h Ig D-Fc-Ig(10,30μg/ml)增加了其凋亡率;PI流式检测结果显示h Ig D(3μg/ml)下调了Daudi和Ramos细胞G1期的比例,增加了S期的比例,G2期变化不明显,h Ig D-Fc-Ig(10,30μg/ml)使Daudi和Ramos细胞周期阻滞在G1期。进一步检测Daudi和Ramos细胞c-myc、cyclin D3、CDK6和p16~(INK4a)因子的蛋白表达,Western结果显示:与对照组相比,h Ig D(3μg/ml)刺激后Daudi和Ramos细胞c-myc、cyclin D3、CDK6的蛋白表达明显升高,p16~(INK4a)表达明显降低,而h Ig D-Fc-Ig(10,30μg/ml)作用后下调了c-myc、cyclin D3、CDK6的蛋白表达,上调了p16~(INK4a)的表达。结论:1.Daudi和Ramos细胞表面均有IgDR的表达。2.h Ig D、h Ig D-Fc及h Ig D-Fc-Ig均可与Daudi和Ramos细胞上IgDR结合,且与Daudi细胞上IgDR结合的亲和力高于Ramos细胞。3.在Daudi和Ramos细胞上h Ig D、h Ig D-Fc及h Ig D-Fc-Ig与IgDR结合的亲和力大小均为h Ig D-Fch Ig D-Fc-Igh Ig D。4.h Ig D加快Daudi和Ramos细胞周期进程,减少细胞凋亡,促进细胞增殖,可能与其调控c-myc与cyclin D3-CDK6-p16~(INK4a)表达有关。5.h Ig D-Fc-Ig阻断了h Ig D的上述作用:抑制Daudi和Ramos细胞的增殖,增加细胞凋亡,使细胞周期阻滞在G1期,可能是通过阻滞Ig D-IgDR通路发挥作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R96

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 陈恒石;吴育晶;黄琼;陈文生;董进;魏伟;;流式细胞术检测IgD与IgD受体结合实验方法的建立[J];安徽医科大学学报;2016年08期

2 戴杏;贾晓益;吴育晶;魏伟;;B细胞受体信号及其靶向抑制剂在恶性淋巴瘤中的作用[J];中国药理学通报;2014年05期

3 龚晶淼;;mTOR抑制剂的研究进展[J];中国实用医药;2009年09期

，

本文编号：1543013