中药白头翁质量控制和白桦脂酸体内外代谢研究

发布时间：2018-03-04 12:49

本文选题：白头翁　切入点：五环三萜皂苷　出处：《河北医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：白头翁(Pulsatilla chinensis(Bge.)Regel)为毛茛科(Ranunculaceae)白头翁属(Pulsatilla)植物,是常用的传统中药之一,具有清热解毒、燥湿杀虫和凉血止痢等功效。临床上被广泛地用于细菌性痢疾、阿米巴痢疾、阴道滴虫、细菌感染和恶性肿瘤等疾病的治疗。白头翁在我国河北、内蒙古、陕西、甘肃、安徽、河南以及湖北等省均有广泛分布,且不同产地的白头翁化学成分存在明显差异。因此,定量和定性分析白头翁中主要的有效成分对于药材的质量评价十分重要。中药作为复杂成分体系,其质量控制研究需围绕“多成分”、“多靶点”的特点。故本研究建立了液质联用(UPLC-ESI-MS/MS)技术结合组织破碎法同时测定白头翁中12个主要化学成分含量的方法,并采用主成分分析方法对不同产地的白头翁进行质量分析,为白头翁药材的质量控制提供科学依据。建立UPLC-Q-TOF-MS/MS法分析总结五环三萜皂苷类成分及其同分异构体的质谱裂解规律,并且结合全面、系统的五环三萜皂苷类化合物的定性分析策略,快速识别和鉴定白头翁中五环三萜皂苷类化合物以及同分异构体。最终鉴定出22个五环三萜皂苷类化合物,并且区分两大类、11对同分异构体。本研究为阐明中药材质量差异提供了有效的技术手段,并为富含五环三萜皂苷类成分中药的质量控制提供理论依据,从而为全面深入地研究中药活性化学成分与中药药效的相关性奠定基础。白桦脂酸(Betulinic acid,BA)是一种五环三萜类有机酸,为白头翁中主要活性成分之一。药理学研究表明其对HIV-1型感染具有抑制作用,并且具有抗肿瘤活性。本实验建立借助UPLC-Q-TOF-MS/MS技术鉴定白桦脂酸体内外代谢物的检测方法,并将其运用于给药大鼠粪便及微生物转化的代谢物鉴定,并推断其代谢途径,探寻白桦脂酸在体内的代谢过程,为白头翁中五环三萜皂苷类成分的体内代谢研究提供理论依据。第一部分液质联用法同时测定白头翁药材中12种主要化学成分及其主成分分析目的:建立UPLC-ESI-MS/MS方法同时测定白头翁药材中β-蜕皮甾酮、筋骨草甾酮C、常春藤皂苷C、刺人参皂苷S、白头翁皂苷C、23-羟基羽扇豆-20(29)-烯-28-酸-3-O-[阿拉伯糖基-吡喃鼠李糖基]-28-O-[吡喃葡萄糖酯苷](C47H76O17)、白头翁皂苷B4、常春藤皂苷B、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、23-羟基白桦脂酸和常春藤皂苷元12种成分的含量,并采用主成分分析方法(PCA)对不同产地白头翁进行质量分析,为白头翁药材质量标准的建立和质量控制提供依据。方法:采用Phenomenex Kinetex-C18色谱柱(100×3 mm,2.6mm),流动相为甲醇含0.1%甲酸-0.1%甲酸水溶液,梯度洗脱,流速为0.4m L/min,柱温为40oC。采用电喷雾离子源进行正、负离子模式扫描,多反应监测模式进行定量测定。离子源温度为150oC,毛细管电压为2.0 k V,脱溶剂气温度为500oC,脱溶剂气流量为800 L/Hr,锥孔气流量为150L/Hr,雾化气压力为7.0 Bar,接口处加热。结果:12种主要化学成分的峰面积和浓度在测定浓度范围内线性关系良好,仪器重复性、日内和日间精密度、溶液稳定性均符合要求。平均加样回收率为97.6-104.2%,RSD小于4.7%。定量分析结果显示,不同产地的33批白头翁药材中均含有刺人参皂苷S,然而其在不同产地药材中的含量具有明显的差异。PCA结果显示,33批样品在主成分空间中聚集成两大类,表明产地对药材的质量差异产生一定的影响。结论:本研究建立的分析方法具有操作简便、快速、专属性强、灵敏度高的优势,可应用于白头翁药材中多种活性成分的同时定量测定。同时,PCA法可为白头翁药材分类和质量评价提供依据,有助于合理、规范地指导中医临床用药。第二部分基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术快速鉴定白头翁中五环三萜皂苷类化合物目的:研究并总结五环三萜皂苷类化合物在正负离子模式下的电喷雾质谱裂解规律,建立全面、系统的化合物鉴定分析策略,鉴定白头翁中五环三萜皂苷化学成分及同分异构体。方法:首先采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术,电喷雾离子源正、负离子模式下一级质谱扫描、母离子扫描和子离子扫描模式,研究了8个具有代表性的五环三萜皂苷类成分对照品的质谱裂解途径,总结其规律。结合相关文献,建立白头翁属植物五环三萜皂苷化合物的质谱库。通过对化合物精确质量数、碎片离子信息和保留时间分析,鉴定白头翁中五环三萜皂苷类化学成分。色谱柱为Agilent Poroshell 120 SB-C18色谱柱(2.1 mm×100mm,2.7μm),柱前具有配套的预柱;柱温为40oC;流动相为水-0.1%甲酸(A)~甲醇-0.1%甲酸(B),流速为0.3 m L/min,采用梯度洗脱方式,进样前预平衡10 min,进样量为5μL。结果:通过与对照品的色谱行为、精确质量数和二级碎片信息对比,分别对8个五环三萜皂苷色谱峰进行归属。峰3、4、7、14、17、18、21和22分别被鉴定为白头翁皂苷B4、常春藤皂苷C、白头翁皂苷C、常春藤皂苷B、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、23-羟基白桦脂酸和常春藤皂苷元。同时,基于化合物鉴定分析策略推断出22个(11对)五环三萜皂苷的化学结构。结论:本研究所建立的UPLC-Q-TOF-MS/MS方法灵敏度高、专属性强,其分析策略可为白头翁属其他植物以及传统中药化学成分的定性分析鉴定提供有力的技术支持,对控制中药材质量具有十分重要的意义。第三部分UPLC-Q-TOF-MS/MS法鉴定白桦脂酸大鼠体内外代谢物目的:采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对大鼠口服给予白桦脂酸后粪便中的代谢产物及肠道菌微生物转化的代谢产物进行结构鉴定,并推测其代谢途径。方法:首先,采用液-液萃取方法对生物样品进行预处理,UPLC-Q-TOF-MS/MS方法采集数据。第二步,运用Metabolite Pilot 1.5软件中的多种数据后处理技术(提取离子流色谱、多重质量亏损过滤、碎片离子过滤和中性丢失过滤)对采集到的数据进行准确快速的提取和识别,获得代谢物的精确质量数、元素组成和MS/MS质谱图。最后根据精确质量数、相关的生物代谢转化规律和白桦脂酸的裂解规律,对白桦脂酸的代谢产物进行结构推断并且利用Clog P值辅助区分同分异构体。结果:基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术,大鼠口服给予白桦脂酸后粪便样品及肠道菌微生物转化样品中除母药外共检测到46个代谢物,肠道菌微生物转化样品检测到20个代谢物,大鼠粪便样品检测到35个代谢物,有7个代谢物在两种生物样品中均能检测到。结论:本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS检测技术,成功地识别和鉴定了大鼠口服给予白桦脂酸后粪便中的代谢物及肠道菌微生物转化的代谢物,为白桦脂酸在体内的代谢过程和药理作用机制的阐明奠定了基础。该方法快速、灵敏,可用于其他单体成分和中药材进入体内的代谢物分析。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R284.1;R285.5

【参考文献】