益气活血方对心肌梗死大鼠心肌线粒体自噬及细胞凋亡影响的研究

发布时间：2018-03-17 16:16

本文选题：细胞凋亡　切入点：心肌梗死　出处：《北京中医药大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景与目的心肌梗死后,氧化应激诱发的心肌细胞凋亡是心室重构发生的重要原因,而同样由氧化应激诱发的线粒体自噬也参与了心肌梗死后病理进程,但其作用具有心肌保护或损伤的"双重性"。依据传统中医气血理论创立的益气活血方是临床常用治疗心肌缺血的经验方,具有益心益气,活血通脉的功效。前期研究表明益气活血方可以有效改善心肌梗死患者临床症状与心功能,改善冠脉微循环障碍。对心梗患者的心功能恢复起到积极作用,近年来,随着对自噬这一现象研究的深入,发现自噬在诸多生理病理过程中发挥广泛的生物学作用。因此,本研究从心肌梗死后心肌细胞凋亡与线粒体自噬的变化情况,研究益气活血方防治心肌损伤的作用机理。方法1运用结扎SD大鼠冠状动脉左前降支的方法复制心肌梗死动物模型,随机分为模型组、益气活血方组、培哚普利组,并设置假手术组,共4组。各组于术后第2天开始分别灌胃相应药物,每日一次,观察治疗后7、28天两个时间节点相关指标的变化。2检查各时间节点心肌梗死大鼠心脏功能、结构变化,评估心梗模型复制的成功情况及益气活血方对心梗大鼠心功能的影响。3光镜观察心肌梗死大鼠心脏组织细胞病理结构,透射电镜观察线粒体结构、形态的变化以及自噬小泡的数量,探究益气活血方对心梗大鼠心肌的保护作用及对心肌线粒体自噬的影响。4用双抗体夹心酶联免疫法检测心梗大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)变化,探究益气活血方对心梗大鼠抗氧化能力的影响。5用蛋白质印迹法(WesternBlotting)和实时荧光定量法(RT-PCR)检测心肌梗死边缘区组织中自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Beclin1mRNA及蛋白表达水平的变化,观察心梗大鼠心肌线粒体自噬变化及益气活血方对其的影响。6采用蛋白质印迹法观察细胞色素(CytC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)蛋白表达情况,评价大鼠心肌梗死心肌细胞凋亡变化及益气活血方对其影响。结果实验研究包括5个部分实验一,益气活血方对心梗后心功能的影响情况:与假手术组相比,模型组大鼠左室射血分数(LVEF)、左室短轴率(LVFS)明显下降,左室收缩末期内径(LVIDs)、左室舒张末期内径(LVIDd)明显增加,左室舒张末期容积(EDV)、左室收缩末期容积(ESV)明显增加(P0.01)。7天时,与模型组比较,给药组LVEF,LVFS明显升高,差异明显(P0.01 或 P0.05),LVIDs、LVIDd,EDV、ESV 呈缩减趋势,但无统计学意义(P0.05)。28天时,与模型组比较,给药组LVEF,LVFS明显升高,EDV、ESV缩减,差异明显(P0.05)。益气活血方组LVIDs,LVIDd明显缩减(P0.05),培哚普利组LVIDd明显缩减(P0.05),LVIDs缩减但无统计学意义(P0.05)。结果表明,心肌梗死后左心室扩张,舒缩功能下降,运用益气活血方可以减轻左心室扩张,改善左心室舒缩功能,对心梗后的心功能恢复起积极作用。实验二,益气活血方对心肌梗死模型大鼠梗死边缘区心肌组织细胞及线粒体形态的影响:光镜显示:7天时,假手术组大鼠心肌细胞排列整齐,纹理清晰,偶有断裂,心肌纤维结构清楚,未见明显炎性细胞浸润;心肌梗死组大鼠心肌细胞排列紊乱,纹理走向不确定,可见灶性心肌纤维走形中断,心肌细胞核溶解、消失,大量炎性细胞浸润;益气活血组病理性改变与心肌梗死组相似,但病变范围减小,培哚普利组病理性改变与模型组相类似,但病变的范围与模型组相比较有所减小。28天时,假手术组心肌细胞核排列整齐,纹理清晰,心肌纤维结构清楚,与7天的组织形态结构无明显区别;心肌梗死组大鼠心肌细胞排列紊乱,纹理走向不确定,可见大量灶性心肌纤维走形中断;培哚普利组大鼠心肌细胞增生明显,重新排列较规整,较心肌梗死组病变范围减小,与7天的相比两用药组病理表现有所减轻。电镜显示:7天时,模型组线粒体空泡化明显,有自噬体形成.,用药组可见少量自噬泡,较模型组减轻。28天时,模型组线粒体数量异常增生,形态紊乱,空泡化明显,自噬泡少见;用药组线粒体结构较清晰,可见自噬泡,较模型组明显。结果表明,心肌梗死后,大鼠心肌细胞发生死亡、间质纤维化等病理改变,心肌细胞线粒体形态结构破坏明显,自噬现象随时间增加逐渐减少。结果表明,益气活血方可以减轻心肌细胞死亡,减轻心肌细胞线粒体结构破坏,并随着时间增加增加自噬现象的发生。实验三,探究益气活血方对心肌缺血模型大鼠血清抗氧化相关分子SOD、GSH-Px的影响:与假手术组相比,模型组大鼠SOD,GSH-PX明显下降,差异明显(P0.01)。与模型组比较,益气活血方组,培哚普利组SOD,GSH-PX明显升高,差异明显(P0.01或P0.05)。结果表明心肌梗死后,大鼠抗氧化能力下降,运用益气活血方可以增加大鼠抗氧化能力。实验四,探究益气活血方对心肌梗死大鼠梗死边缘区心肌组织自噬相关分子LC3、Beclin1基因、蛋白表达的影响:在基因表达方面,7天时,与假手术组大鼠相比,心肌梗死组LC3、Beclin1基因表达显著升高(P0.01);与心肌梗死组大鼠相比,益气活血方组LC3基因表达有下降趋势但无统计学差异,Beclin1基因表达降低,培哚普利组L C3、Beclin1基因表达降低。28天时,与假手术组大鼠相比,心肌梗死组LC3、Beclin1基因表达显著升高(P0.01);与心肌梗死组大鼠相比,益气活血方组与培哚普利组LC3、Beclin1基因表达显著升高(Pall0.01)。在蛋白表达方面,7天时,与假手术组大鼠相比,心肌梗死组LC3A、LC3B、Beclin1蛋白表达均显著升高(P0.01);与心肌梗死组大鼠相比,益气活血方组与培哚普利组LC3A、LC3B、Beclin1蛋白表达均显著下降(Pall0.01)。28天时,与假手术组大鼠相比,心肌梗死组LC3A、LC3B、Beclin1蛋白表达均显著升高(P0.01);与心肌梗死组大鼠相比,益气活血方组与培哚普利组LC3A、LC3 B、Beclin1蛋白表达均升高。结果表明,心肌梗死后,自噬蛋白与基因表达于7天时增加,28天时减少,运用益气活血方可以于7,28天动态调节心肌细胞自噬蛋白与基因表达,即于7天时抑制,28天时促进。实验五,探究益气活血方对心肌缺血模型大鼠梗死边缘区心肌组织细胞凋亡相关分子CytC,caspase-3蛋白表达的影响:7天时,模型组CytC、caspase-3蛋白表达较假手术组明显升高(P0.05),两用药组蛋白表达降低。28天时,模型组Cyt C、caspase-3蛋白表达较假手术组呈升高趋势,药物干预后呈降低趋势,但无明显统计学差异。结果表明心肌梗死后,凋亡现象于7天时更为显著,运用益气活血方可以减轻心肌细胞凋亡。28天时虽然凋亡现象不显著,但益气活血方仍呈现减轻心肌细胞凋亡的作用的趋势。结论1益气活血方可有效改善心肌梗死大鼠心脏结构与功能变化,提高大鼠心肌细胞抗氧化能力,抑制心肌梗死后心室重构早期心肌细胞凋亡。2心肌细胞线粒体自噬现象随时间节点改变,益气活血方于不同时间节点分别抑制与促进自噬,发挥心肌保护作用。
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【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】