人胎儿真皮间充质干细胞对瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学活性的影响
本文选题:胎儿真皮间充质干细胞 切入点:瘢痕疙瘩 出处:《山东大学》2017年硕士论文 论文类型:学位论文
【摘要】:研究背景瘢痕疙瘩是一种由成纤维细胞异常增殖和胶原过度沉积导致的皮肤纤维化疾病。由于该疾病形成机制复杂,目前研究尚未能完全揭示其发病原因和生长机制,临床上也未出现效果理想的治疗方案,所以新的治疗方案亟待出现。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)因其抗纤维化作用已在肺纤维化、心肌梗塞等纤维化疾病治疗方面崭露头角,而人胎儿真皮间充质干细胞(Fetal dermal mesenchymal stem cells,FDMSCs)被认为在早期胎儿无瘢痕愈合中起到决定性作用的细胞,但是,该细胞是否可应用于瘢痕疙瘩的治疗方面还未见文献报道。目的通过研究 FDMSCs 条件培养基(FDMSCs conditioned medium,F-CM)对瘢痕疙瘩成纤维细胞(Keloid fibroblasts,KFs)生物学活性的影响,探索FDMSCs相关疗法治疗瘢痕疙瘩的可行性。方法分别提取并鉴定成人真皮成纤维细胞(Adult dermal fibroblasts,ADFs)、FDMSCs和KFs,并应用ADFs和FDMSCs制备ADFs条件培养基(ADFs conditioned medium,A-CM)和 F-CM。KFs 分别用空白对照培养基(SFM)、A-CM和F-CM培养,培养48h后对各组KFs进行一系列实验分析,包括细胞形态观察(倒置显微镜下)、细胞数量变化(MTT比色实验)、细胞增殖率和凋亡率改变(BrdU细胞增殖实验和TUNEL细胞凋亡实验)、细胞共培养干预实验和条件培养基干预实验对比、凋亡相关基因和蛋白的表达变化(qPCR和Western blot)、细胞凋亡时期检测(Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测)结果通过一系列实验,结果显示相对于对照组和A-CM组,F-CM可以诱导KFs出现凋亡形态,并可减少活细胞的数目。但KFs增殖率没有明显改变但凋亡率明显增加,这说明细胞数目的减少主要得益于细胞凋亡的增多。FDMSCs与KFs共培养实验的结果同培养基干预KFs实验结果没有明显区别。进一步实验表明F-CM可促进细胞促凋亡蛋白BCL-2的表达并抑制细胞抑凋亡蛋白BAX的表达,导致BCL-2/BAX升高而促进细胞凋亡。Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡实验结果表明细胞凋亡时期主要为晚期凋亡。结论(1)FDMSCs可成功从早期人胎儿皮肤中提取并进行体外培养、传代,并能维持稳定的生物学特性。(2)F-CM干预KFs实验结果与细胞共培养干预实验结果一致,避免了 FDMSCs直接应用于机体的潜在风险。(3)F-CM可以通过抑制细胞抑凋亡蛋白BCL-2的表达并促进细胞促凋亡蛋白BAX的表达来促进细胞凋亡。(4)F-CM所诱导的KFs凋亡时期主要为晚期凋亡。
[Abstract]:Background keloid is a disease of skin fibrosis caused by abnormal proliferation of fibroblasts and excessive deposition of collagen. There is no ideal therapeutic plan in clinic, so a new treatment is urgently needed. Mesenchymal stem cells (MSCs) have emerged in the treatment of pulmonary fibrosis, myocardial infarction and other fibrosis diseases because of its anti-fibrosis effect. Human fetal dermal mesenchymal stem cells (Fetal dermal mesenchymal stem cells FDMSCs) are thought to play a decisive role in early fetal scarless healing, however, It has not been reported whether this cell can be used in the treatment of keloid. Objective to study the effect of FDMSCs conditioned medium conditioned mediumF-CMon on the biological activity of keloid fibroblasts (KFs). To explore the feasibility of FDMSCs related therapy in the treatment of keloid. Methods FDMSCs and FDMSCs were used to prepare ADFs conditioned medium conditioned mediumA-CMCs and F-CM.KFs were cultured in blank control medium SFMA-CM and F-CM respectively. After 48 hours of culture, a series of experiments were carried out on KFs in each group. The cell morphology was observed under inverted microscope, the cell number was changed by MTT colorimetric assay, the cell proliferation rate and apoptosis rate were changed by BrdU cell proliferation test and TUNEL cell apoptosis test, the cell co-culture intervention experiment and the conditioned medium intervention experiment were compared. The expression of apoptosis-related genes and proteins was detected by qPCR and Western blottir. The results of apoptosis detection of Annexin V-FITC / Pi double staining cells showed that F-CM could induce apoptosis of KFs compared with control group and A-CM group. But the proliferation rate of KFs did not change obviously, but the apoptosis rate increased obviously. This indicated that the decrease of cell number was mainly due to the increase of apoptosis. The results of co-culture of FDMSCs and KFs were not significantly different from those of medium intervention in KFs. Further experiments showed that F-CM could promote apoptosis protein BCL-2. And inhibit the expression of BAX, a cell inhibitor of apoptosis, The results showed that the apoptosis stage was mainly late apoptosis. Conclusion BCL-2/BAX can be successfully extracted from the early human fetal skin and cultured in vitro. The results of F-CM intervention in KFs were consistent with those of co-culture. In order to avoid the potential risk of direct application of FDMSCs, F-CM can promote the apoptosis of KFs by inhibiting the expression of BCL-2 and promoting the expression of apoptosis-promoting protein BAX. The apoptosis stage of KFs induced by F-CM is mainly late apoptosis.
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R622
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,本文编号:1638766
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