黄芪甲苷和葛根素对高糖诱导大鼠心肌细胞ERS介导的凋亡通路的影响

发布时间：2018-03-23 18:42

本文选题：周亡　切入点：内质网应激　出处：《北京中医药大学》2017年硕士论文

【摘要】：背景:心血管疾病是全球致死率排行第一的慢性疾病,而糖尿病已经被证明是心血管事件的一项高危因素。近年来糖尿病心肌病的发病率一直在不断地增高,糖尿病心肌病发生的根本原因是糖尿病患者血糖的升高。心肌细胞的凋亡是糖尿病心肌病非常重要的病理表现,并且通过减缓高血糖引起的心肌凋亡已经被证实可以有效地预防糖尿病引起的心血管事件。近期与心肌细胞凋亡的调节机制相关的研究正不断深入,细胞内质网应激介导的凋亡通路越发受到重视。对于内质网应激介导的凋亡机制的研究更可为中药防治糖尿病心肌病的应用阐明新的原理。目的:探究糖尿病心肌病发病过程中H9C2细胞内质网应激的发生与变化情况,通过观察大鼠心肌细胞H9C2内质网应激及其诱导的凋亡通路中相关指标的mRNA和蛋白的表达情况,探讨中药黄芪甲苷联用葛根素对糖尿病心肌病的参预效果及机制。方法:(1)通过CCK-8法确定各浓度刺激物作用相应时间后对H9C2细胞是否具有毒性。(2)通过流式细胞仪检测应用不同浓度甘露醇、葡萄糖及毒胡萝卜素刺激后H9C2细胞的凋亡情况并通过Real-time PCR评价细胞中GRP78、IRE1 α及CHOP的表达情况。(3)不同浓度的黄芪甲苷及葛根素分别刺激H9C2细胞24、48、72小时后同正常组与高糖组对比,通过Real-time PCR方法评价GRP78、IRE1 α及CHOP的表达情况。(4)通过Real-time PCR方法检测ERS抑制剂4-PBA三种不同浓度刺激24、48、72小时后H9C2细胞GRP78的表达情况。(5)将低糖培养的H9C2大鼠心肌细胞分为正常组、甘露醇对照组、高糖组、毒胡萝卜素组、给药组及抑制组,正常组用低糖培养基刺激,高糖组用高糖培养基刺激,给药组用含葛根素及黄芪甲苷标准品的高糖培养基刺激,甘露醇对照组用加入30.5mmol/L甘露醇的低糖培养基刺激,抑制组用含有5mmol/L的内质网应激抑制剂4-PBA的高糖培养基刺激,上述各组均刺激24小时后,通过Real-time PCR及Western Blotting 方法检测目标基因及蛋白 GRP78,IRE1 α,CHOP,PUMA,XBP1u,XBP1s 的表达情况。结果:(1)CCK-8结果实验所用刺激物、药物的不同浓度组及不同刺激时间组与正常组间的细胞吸光度均没有统计学差异(P0.05)。(2)流式细胞仪检测细胞凋亡结果24小时各浓度及时间的高糖与毒胡萝卜素刺激均不能诱发H9C2细胞的凋亡,48小时的各浓度葡萄糖组及2 μmol/L、4 μmol/L浓度毒胡萝卜素不能诱导出细胞凋亡,72小时140mmol/L的葡萄糖及4μmol/L、8μmol/L的毒胡萝卜素可诱导细胞出现凋亡。不同浓度的葡萄糖及毒胡萝卜素各3组分别刺激H9C2细胞24小时、48小时、72小时的PCR结果均显示GRP78,IRE1α,CHOP指标的表达均比正常组增高,毒胡萝卜素各组较高糖各组的表达也升高,差异均有统计学意义。(3)24小时和48小时的低、中、高剂量的黄芪甲苷组和葛根素组相应指标较高糖组均出现下降,且与高糖组有统计学差异,72小时葛根素低剂量组的IRE1 α较高糖组没有统计学差异,各组CHOP的表达较高糖组均没有统计学差异。(4)PCR结果显示各浓度4-PBA刺激24小时内质网应激抑制组均可检测到GRP78表达较正常组下降,且差异有统计学意义。(5)Real Time PCR检测各目标基因mRNA表达量,除XBP1u是高糖组较正常组表达下降、毒胡萝卜素组较正常组无统计学差异及给药组较高糖组降低外,其他各基因均为高糖组及毒胡萝卜素组较正常组及甘露醇对照组表达增高,给药组及抑制组较高糖组表达下降,统计学均有统计学差异。(6)Western blotting 结果显示,GRP78、IRE1 α、XBP1S、CHOP、PUMA 蛋白表达量均为高糖组及毒胡萝卜素组较正常组及甘露醇对照组表达增高,给药组及抑制组较高糖组表达下降,统计学均有统计学差异。结论:(1)长时间持续的高强的内质网应激可以诱发H9C2细胞的凋亡,本实验中单纯的高糖刺激(最长72小时)以及早期的毒胡萝卜素刺激并不能直接诱发H9C2细胞的凋亡,但均可以诱发H9C2细胞启动内质网应激。(2)黄芪甲苷及葛根素对高糖刺激H9C2细胞的内质网应激状态及其诱发的凋亡通路起到抑制作用,但是后期对于凋亡通路的抑制作用欠佳。(3)黄芪甲苷联用葛根素对于高糖诱导的H9C2细胞内质网应激及其诱发的凋亡通路相关基因和蛋白表达的抑制效果要优于单用的效果。
[Abstract]:BACKGROUND : Cardiovascular disease is the first chronic disease in the world , and diabetes has been proved to be a high risk factor for cardiovascular events . The study of the mechanism of apoptosis in diabetic cardiomyopathy has been shown to be very important in recent years . Results : ( 1 ) There was no significant difference in the expression of GRP78 , IRE1.伪 , CHOP , PUMA , XBP1u and XBP1s in the control group . ( 4 ) The expression of GRP78 , IRE1.alpha , XBP1S , CHOP and PUMA was significantly higher than that in normal group and mannitol group .

【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】