TDAG8在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用及其机制的研究

发布时间：2018-03-23 19:31

  本文选题：TDAG8　切入点：BTB09089　出处：《江苏大学》2017年硕士论文

【摘要】：脑卒中是最严重的和最致命的神经系统疾病,是全世界导致死亡的第二大原因,并且是导致大多数地区成年人严重残疾的最主要的因素,严重影响着患者的生活质量。缺血性脑卒中是最主要的脑卒中类型,主要是由于大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)引起。T细胞死亡相关基因8(T cell death associated gene 8,TDAG8)是一种质子敏感的G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor,GPCR),主要在免疫细胞通过组氨酸残基与细胞外质子相互作用从而调控细胞内生物学活动。最近研究表明TDAG8在大鼠脑组织广泛表达,尤其是前脑边缘区域,比如下丘脑、杏仁核、海马、额叶皮层和纹状体等,并被特异性激动剂BTB09089激活。尽管活化的TDAG8广泛参与炎症、免疫、疼痛和凋亡等的调节,但是其是否参与脑缺血再灌注损伤的调节及其潜在的作用机制并不十分清楚。本研究拟在建立的大鼠短暂性脑缺血再灌注损伤模型中,观察TDAG8及其可能的下游蛋白在大鼠脑皮层缺血半暗带区域的表达变化;其次通过侧脑室注射BTB09089激动TDAG8或应用基因干扰技术抑制TDAG8的表达,观察其对大鼠脑梗体积、神经行为学及其下游蛋白表达的影响;最后探讨TDAG8调节脑缺血再灌注损伤的可能机制。本研究将通过探讨TDAG8对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响及其作用机制,为治疗脑缺血再灌注损伤提供新的治疗靶点及理论依据。目的(1)探索TDAG8在大鼠脑缺血再灌注损伤中的表达变化。(2)探索BTB09089经大鼠侧脑室注射后对TDAG8表达的影响。(3)探索SiRNA经大鼠侧脑室注射后对TDAG8表达的影响。(4)探索TDGA8及其下游Akt信号通路对大鼠脑缺血再灌注诱导的神经元凋亡和缺血后炎症反应的影响。方法(1)清洁级健康成年雄性SD大鼠24只,体重270-280 g。按随机数字表法随机分为5组(n=4):假手术组(sham组),大脑中动脉阻塞再灌注3 h组(I/R3 h组),I/R 6 h组,I/R 12 h组和I/R 24 h组。Sham组不做任何处理;各灌注组行大脑中动脉栓塞2 h后再灌注相应的时间后断头取脑,提取缺血半暗带脑组织。此外,原代皮层神经元在氧糖剥夺处理后(ogd)的3h,6h,12h和24h提取神经元蛋白。用westernblot和qrt-pcr检测缺血半暗带tdag8的表达变化。(2)清洁级健康成年雄性sd大鼠16只,体重270-280g。按随机数字表法随机分为4组(n=4):正常组(normal组),btb090895μm组(btb5μm组),btb10μm组和btb20μm组。normal组不做任何处理,btb5μm组侧脑室注射5μm的btb09089,btb10μm组侧脑室注射10μm的btb09089和btb20μm组侧脑室注射20μm的btb09089,每组给予8μl。药物处理6h后断头取脑,提取前脑边缘区域皮层脑组织。用westernblot和qrt-pcr检测tdag8的表达变化。此外,为了检测btb09089是否具有细胞毒性,分别用不同浓度的btb09089作用于神经元,在指定的时间点检测神经元细胞活性。(3)清洁级健康成年雄性sd大鼠20只,体重270-280g。按随机数字表法随机分为5组(n=4):正常组(normal组),转染试剂组(vehicle组),sirna阴性对照组(sirna-c组),sirna组和sirna阳性对照组(sirna-β-actin组)。normal组不做任何处理,vehicle组侧脑室只注射等量的转染试剂,sirna-c组只注射4μg序列错配的sirna,sirna组注射4μg针对tdag8特异性设计的sirna,sirna-β-actin组注射4μg针对β-actin特异性设计的sirna。处理24h后断头取脑,提取前脑边缘区域皮层脑组织。用westernblot和qrt-pcr检测tdag8的表达变化。(4)清洁级健康成年雄性sd大鼠48只,体重270-280g。按随机数字表法分为8组(n=6):sham组,mcao组,vehicle组,btb5μm组,btb10μm组,btb20μm组,sirna-c组,sirna组和sirna+btb20μm。btb5μm组,btb10μm组,btb20μm组在mcao前6h经侧脑室分别注射8μl5μm、10μm和20μm的btb09089;sirna-c组、sirna组和sirna+btb20μm组在mcao前24h经侧脑室分别注射4μg(8μl)的sirna-c、sirna和sirna,其中sirna+btb20μm组再在mcao前6h经侧脑室注射8μl20μm的btb09089;sham组仅做手术不栓塞大脑中动脉,mcao组短暂堵塞大脑中动脉2h后再灌注,vehicle组在缺血再灌注前24h给予适量转染试剂。在再灌注后6h断头取脑,用westernblot和qrt-pcr检测缺血半暗带促凋亡因子caspase-3、和cleavedcaspase-3、抗凋亡因子bcl-2和tdag8下游相关蛋白磷酸化akt(p-akt)和磷酸化creb(p-creb)的表达,以及用qrt-pcr检测炎症因子tnf-α,mcp-1和il-1β的表达。分别在再灌注后24h和72h评估神经功能缺陷评分和检测脑梗体积。结果(1)在mcao模型:与sham组比较,tdag8在i/r3h左右表达增加,持续到24h,并在i/r6h左右达到峰值。在ogd模型:与sham组比较,tdag8在复氧3h左右表达增加,持续到24h,并在复氧24h左右达到峰值。(2)与normal组比较,btb5μm组tdag8的表达增加,与btb5μm组比较,btb10μm组tdag8的表达增加,与btb10μm组比较,btb20μm组tdag8的表达上调。与normal组比较,btb090895μm组、10μm组、20μm组和40μm组细胞活性均大于95%。(3)normal组、vehicle组和sirna-c组tdag8的表达差异无统计学意义。与normal组比较,sirna组抑制tdag8的表达;而与sirna组比较,sirna-β-actin组抑制β-actin的表达。(4)与sham组比较,mcao组脑梗体积增大,神经功能缺陷评分降低,tnf-α、mcp-1、il-1β、cleavedcaspase-3、p-akt和p-creb表达增高,bcl-2表达降低;btb5μm组和mcao组差异无统计学意义;而与mcao组比较,btb10μm组脑梗体积降低,神经功能缺陷评分升高,tnf-α、mcp-1、il-1β和cleavedcaspase-3表达降低,bcl-2、p-akt和p-creb表达升高;与btb10μm组比较,btb20μm组脑梗体积降低,神经功能缺陷评分增高,tnf-α、mcp-1、il-1β和cleavedcaspase-3表达降低,bcl-2、p-akt和p-creb表达升高;mcao组和vehicle组、sirna-c组差异无统计学意义;与mcao组比较,sirna组脑梗体积升高,神经功能缺陷评分降低,tnf-α、mcp-1、il-1β和cleavedcaspase-3表达升高,bcl-2、p-akt和p-creb表达降低;sirna+btb20μm和sirna组差异无统计学意义。结论(1)tdag8在大鼠脑缺血再灌注损伤中有意义的表达上调。(2)大鼠侧脑室注射btb09089能够促进tdag8的表达,没有明显的细胞毒性。(3)大鼠侧脑室注射TDAG8-siRNA能够抑制TDAG8的表达。(4)活化TDAG8可能通过Akt信号通路抑制大鼠脑缺血再灌注诱导的神经元凋亡和缺血后炎症反应。
[Abstract]:Stroke is the most serious and deadly diseases of the nervous system, is the world's second leading cause of death, and is the most important factor leading to the majority of adults severely disabled, seriously affect the quality of life of patients with ischemic stroke. Stroke is the most common type, mainly due to middle cerebral artery occlusion (middle cerebral artery occlusion, MCAO.T) induced cell death related gene 8 (T cell death associated gene 8, TDAG8) is a proton sensitive G protein coupled receptors (G protein coupled receptor, GPCR), mainly in immune cells by histidine residues and extracellular proton interactions to regulate the biological activity in cells. Recent studies show that TDAG8 is widely expressed in rat brain tissue, especially limbic forebrain regions such as hypothalamus, amygdala, hippocampus, frontal cortex and striatum, and be specific Agonist activation of BTB09089. Although the activation of TDAG8 are involved in inflammation, immune regulation, pain and apoptosis, but whether it is involved in cerebral ischemia reperfusion injury and its potential regulation mechanism is not very clear. This study in rats with transient cerebral ischemia reperfusion injury model was established, to observe the expression change TDAG8 and its downstream protein may in the cerebral cortex ischemia penumbra region; followed by intracerebroventricular injection of BTB09089 agonist TDAG8 or application of gene interference to inhibit the expression of TDAG8, to observe the cerebral infarction volume in rats, the influence of God behavior and expression of downstream proteins; finally, the regulation of TDAG8 on cerebral ischemia reperfusion injury the possible mechanism of this study. Through the study of TDAG8 on cerebral ischemia reperfusion injury in rats and its effect mechanism, for the treatment of cerebral ischemia reperfusion injury provides a new therapeutic target 鐐瑰強鐞嗚�轰緷鎹�.鐩�鐨�(1)鎺㈢储TDAG8鍦ㄥぇ榧犺剳缂鸿��鍐嶇亴娉ㄦ崯浼や腑鐨勮〃杈惧彉鍖，

本文编号：1654862