黄癸固体分散体的工艺优化及对1型糖尿病心肌损伤的保护作用研究

发布时间：2018-03-26 02:07

本文选题：T1DM　切入点：心肌细胞凋亡　出处：《吉林大学》2017年硕士论文

【摘要】：作为临床治疗腹泻的经典药物,黄连素(Berberine,BBR)因其广泛的药理活性,如抗氧化、降血糖、降血脂、抗癌、治疗心脑血管疾病等,越来越受到国内外研究者的关注。不过黄连素肠道吸收功能不佳,生物利用率差,长时间服药会造成胃肠道损伤。课题组前期将促肠道吸收剂癸酸钠和黄连素用溶剂法制备成黄癸固体分散体,且获得国家专利(专利号:ZL2008 1 0050679.X,201310095595.9),且课题组的前期工作表明黄癸固体分散体抗糖尿病作用显著优于纯品黄连素和市售黄连素。由于制备黄癸固体分散体过程中需要将黄连素溶解于无水乙醇中加热溶解,而在实际大规模工业化制备过程中无水乙醇存在成本高以及制备过程危险性较高的缺点,所以文章的第一部分对黄癸固体分散体进行工艺优化,具体研究法是:①通过溶剂蒸发法逐级降醇条件下制备黄癸固体分散体,研究黄癸固体分散体中黄连素与各原始物料之间是否发生化学反应,所选用的方法是X-射线衍射检测法、红外光谱检测法、电子扫描电镜检测法。②由工艺成本和溶出曲线筛选出最佳工艺黄癸固体分散体。③对最佳工艺黄癸固体分散体进行生物利用度考察。④急性毒性和亚急性毒性考察,确保其安全性。实验结果表明:①不同制备条件下的黄癸固体分散体含量并没有明显的差别,黄癸固体分散体的红外光谱图显示为各原始物料的特征峰叠加,可以说明各物料之间均没有发生任何化学反应;X-RD表明对于各物料物理混合样品来说,黄连素晶体峰并未消失,而对于黄癸固体分散体而言,其主要特征吸收峰一共有三个,即PEG6000的两个特征峰和黄连素特征峰,黄连素特征峰明显减弱,由此来看黄癸固体分散体中的大部分黄连素是无定型状态;电子扫描电镜显示黄连素纯品外层相对光滑,并且其外形呈针状,一些聚合为束。将基本物料物理混合的样品中,黄连素以晶体形式存在,PEG6000的形态则为形状不一、尺寸不一的癸酸钠与黄连素的附着物,黄癸固体分散体却与其完全不同,黄连素晶体的结晶度明显减弱,几乎不存在晶体附着物,癸酸钠、黄连素主要存在于PEG6000载体中,形态为无定型状态。我们发现70%浓度以下的乙醇溶剂条件下制备的黄癸固体分散体黄连素晶体渐多,说明这些条件下制备的黄癸固体分散体的分散效果不佳。②70%,60%,50%浓度的乙醇溶剂条件下的样品的溶出度都有明显下降,而100%,90%,80%乙醇溶剂条件下制备的黄癸固体分散体溶出度明显高于原研片和盐酸小檗碱,并且没有显著性差异。80%乙醇溶剂条件下的HGSD制备过程中溶解和烘干时间与100%及90%溶剂条件条件下制备的HGSD没有很大区别,成本和危险性综合考虑,将黄连素与PEG6000置于80%的乙醇溶液中加热溶解并得出最佳工艺,并进行中试。③与市售黄连素相比,Tmax由60 min提前到40 min,Cmax明显增加,生物利用度也显著提高;与原工艺相比,没有明显变化。④急性毒性方面,随着黄连素投放量的增加,小鼠活动能力及食欲均无明显变化,不过针对新工艺黄癸固体分散体而言,其剂量分别为1 g/Kg、2 g/Kg、4g/Kg、6 g/Kg的条件下,小鼠全部存活,但给药剂量为6g/Kg时,小鼠的活动能力及食欲明显降低,给予8 g/Kg的新工艺黄癸固体分散体,小鼠死亡1只,由于继续增加给药浓度时发现黄癸固体分散体无法在溶媒中溶解,药物呈糊状无法进行灌胃,我们没有对更高给药剂量对小鼠存活率及活动能力的影响进行探讨。亚急性毒性方面,采用200-220g wistar大鼠雌雄各半,分为Control,100mg/kg,200mg/kg,400mg/kg,800mg/kg剂量组,每组10只,分别给药14天后,取脏器,测血常规和全血生化,凝血因子等指标。其余鼠停止给药,停药7天后测相关指标。研究发现体重,心,肝脏,脑的脏器系数,平均红细胞血红蛋白浓度,白细胞计数,血小板计数,凝血酶原时间,谷丙转氨酶,尿素氮,肌酐,总蛋白,白蛋白,血糖,总胆固醇,钾,氮,钠的浓度都没有显著性差异。谷丙转氨酶,谷草转氨酶有不同程度的升高,但是100mg/kg,200mg/kg,400mg/kg停药7天后恢复正常,800mg/kg仍有小幅度增加。证明,亚急性毒性方面,黄癸固体分散体在100mg/kg,200mg/kg,400mg/kg的剂量下是安全的。实验结果证明新工艺制备下的黄癸固体分散体与前期研究的固体分散体并无明显差别。研究1结果表明新工艺制备黄癸固体分散体与前期研究的原工艺黄癸固体分散体在理化性质上并无显著性差别,而课题组前期工作已经证明黄连素以及以黄连素为主药的黄癸固体分散体对2型糖尿病具有降糖作用,并且其对糖尿病引起的心肌损伤尤其是1型糖尿病引起的心肌损伤是否具有保护作用及其机制尚不清楚。因此,本研究第二部分进行新工艺黄癸固体分散体对1型糖尿病心肌损伤的保护作用研究。具体研究内容如下:①通过腹腔注射链脲佐菌素(简称STZ)构建Wistar大鼠1型糖尿病模型。将大鼠进行随机分组为对照组(Con),模型组(Model),给药组,每组15只。将1型糖尿病大鼠灌胃等量的生理盐水;给药组T1DM大鼠灌胃HGSD-3(200mg/kg);给药时间为4周。②超声心动图显示各组大鼠心功能的变化,HE染色检测各组大鼠心脏病理学变化,TUNEL染色检测各组大鼠心肌细胞凋亡。③Western blotting检测每组大鼠的心肌凋亡相关蛋白、自噬相关蛋白、P-AMPK/AMPK、P-m TOR/m TOR的表达水平。结果表明:①与对照组(Con)相比,Model组体重明显降低,HGSD-3给药4周后体重有明显回升。与对照组(Con)相比,Model组空腹血糖明显升高,HGSD-3给药4周后,空腹血糖有所降低,但并不明显。②与Con组比较,T1DM组大鼠室间隔(IVS)明显升高,心脏射血分数(EF%)水平降低,心功能(E/A)水平降低,HGSD-3组明显改善这种心功能不全现象。心肌HE染色结果得出,对照组核染色清晰,心肌排列整齐;模型组心肌排列错杂,核染色深、心肌细胞肥大、有明显间质纤维化出现;给药组心肌排序稍错杂但核染色清晰,心肌细胞形态完整。TUNEL染色结果显示Model组相对于Con组,TUNEL阳性细胞数目增多,给药组与Model组相比阳性细胞数目减少。③Western blotting结果显示Model组的大鼠心肌组织中,凋亡相关蛋白Bcl-2表达水平降低,凋亡蛋白Cleaved Caspase-3蛋白表达水平明显增加,自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I、P-ULK1/ULK1、Beclin-1的蛋白表达水平减少,P-AMPK/AMPK的蛋白表达水平降低,P-m TOR/m TOR蛋白表达水平明显升高,各蛋白表达量与Con组相比差异显著,具有统计学意义(P0.05,P0.01)。与Model组相比,给药组大鼠心肌组织凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白表达水平增加,凋亡蛋白Cleaved Caspase-3蛋白表达水平降低,自噬相关蛋白P-ULK1/ULK1、LC3-II/LC3-I,Beclin-1的蛋白表达水平明显增加,P-AMPK/AMPK蛋白水平增加,P-m TOR/m TOR的蛋白表达水平降低,各蛋白表达情况差异显著,具有统计学意义(P0.05,P0.01)。综上所述,溶剂为80%的制备方案为筛选出的黄癸固体分散体的最优生产方案,且安全性较高;同时实验也证明了新工艺黄癸固体分散体对1型糖尿病造成的心肌损伤具有保护作用,作用机制可能是通过激活AMPK通路进而激活自噬抑制心肌细胞的凋亡从而保护心肌细胞损伤。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R283.6;R285.5

【参考文献】