周期性牵张力诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中miR-503-5p的作用机制研究

发布时间：2018-03-27 14:14

  本文选题：骨髓间充质干细胞　切入点：周期性牵张力　出处：《山东大学》2017年硕士论文

【摘要】：背景正畸牙移动、牵张成骨和缝牵张技术的共同生物学基础是应力刺激对骨改建和骨塑建的调控作用。作为当前骨组织工程领域的首选研究对象,骨髓间充质干细胞(BMSCs)对机械刺激反应敏感,是力学作用下骨骼改建的细胞学基础之 。生理条件下,适当力值的机械刺激能促使BMSCs成骨分化。miRNAs(microRNAs)是非编码小RNA,它是内源性的,并具有功能调控作用。成熟的miRNAs可通过碱基互补配对的形式识别靶基因mRNA,并对其进行降解或者阻遏其翻译过程,从而发挥生物学功能。研究发现,miRNA能够调控生物体的很多重要生命活动,包括组织器官的发育、细胞的增殖、分化和凋亡以及防御病毒侵袭、促进物质代谢等等。大量miRNAs已被证实对于机械力敏感,且部分应力敏感的miRNAs能够在机械力所致的BMSCs的成骨分化过程中发挥功能调节作用。miR-503-5p,作为本课题组前期基因芯片筛选出的差异表达显著的miRNA,其抑制牵张应力诱导的rBMSCs成骨向分化的功能已经在体内外实验中得到验证。然而,miR-503-5p是如何抑制rBMSCs的成骨分化,其具体的分子调控机制又是怎样的,目前仍不清楚。目的在前期成果miR-503-5p在应力诱导rBMSCs成骨分化中起着重要的负性调控作用的基础上,继续从细胞分子生物学角度入手,利用生物信息学方法预测其可能的靶基因并筛选验证,进一步深入探讨miR-503-5p在力环境下调控成骨分化的分子作用机制,为临床正畸力作用下的骨改建和牙移动提供实验依据和理论基础。方法(1)rBMSCs的获取、培养及干性鉴定,为最适条件下的周期性张应力加载做细胞储备。(2)生物信息学预测:利用miRNA靶基因预测软件如TargetScan、miRwalk等,结合DAVID工具网站、GO富集分析、KEGG-Pathway及相关文献,筛选miR-503-5p可能参与调控的靶基因。(3)双荧光素酶报告基因、qRT-PCR和Western blot共同检测拟研究基因是否为miR-503-5p的靶标基因。(4)siRNA靶向沉默该靶标基因,Western blot分别检测该靶基因及成骨相关因子ALP、BSP、CollgenI、Runx2等蛋白水平表达变化,对靶基因的功能进行验证。结果(1)成功分离培养rBMSCs,流式细胞术鉴定P4代rBMSCs特征表型,结果可见:CD44、CD90(+),CD34、CD45(-),细胞符合实验要求。成骨诱导28后茜素红染色可见钙结节生成,成脂诱导28天后油红O染色可见脂滴形成。(2)miR-503-5p 靶向作用于 Hoxa2、BCL2、IGF2、ACVR2A、SMAD1、BMPR1A等的可能性较大,综合分析拟进一步研究BMPR1A。(3)与非加力组相比,加力组细胞BMPR1A的mRNA及蛋白表达水平上调,且萤火虫和海肾荧光素酶活性的比值显著升高(P0.05)。(4)rBMSCs 分别瞬时转染 miR-503-5p mimic/inhibitor 及 miR-503-5p mimic-NC/inhibitor-NC后检测,mimic组BMPR1A的mRNA及蛋白表达水平较NC组降低(P0.01),而inhibitor组BMPR1A的mRNA及蛋白表达水平较NC组升高(P0.01)。(5)双荧光素酶报告基因结果显示,共转染pmiR-RB-ReportTM-BMPRIA-3'UTR和miR-503-5p mimics组萤火虫和海肾荧光素酶活性的比值显著低于mimic-NC组(P0.01);与之相反,共转染 pmiR-RB-ReportTM-BMPR1A-3'UTR 和miR-503-5p inhibitor组萤火虫和海肾荧光素酶活性的比值显著升高于inhibitor-NC组(P0.01),差异具有统计学意义。(6)与 NC 组相比,SiRNA-BMPR1A 沉默组细胞的 BMPR1A 及 ALP、Runx2、BSP、CollgenⅠ蛋白水平表达下降。结论(1)BMPR1A 是 miR-503-5p 的靶基因。(2)周期性牵张力对rBMSCs成骨向分化的抑制作用是通过miR-503-5p靶向调控BMPR1A实现的。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R781

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本文编号：1671858